重组人骨形成蛋白—3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％。目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽。表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽,经复性处理成可溶性蛋白,植     

重组人骨形成蛋白—3成熟肽的表达,纯化及诱骨活性的研究

推测人骨形成蛋白３羧基端的１２７氨基酸的肽段为其成熟肽（ｈＢＭＰ３ｍ）。将编码此成熟肽的ｃＤＮＡ插入含ＰＬ启动子的表达质粒ｐＤＨ中,构建表达质粒ｐＤＨＢ３ｍ,转化大肠杆菌ＤＨ５α。４２℃热诱导６ｈ后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白２８％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后,溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在９５％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白３成熟肽（ｒｈＢＭＰ３ｍ）植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的ｒｈＢＭＰ３ｍ具有明显的异位诱骨活性。     

人骨形成蛋白－2AcDNA基因工程产物诱骨活性的形态学证明

人骨形成蛋白２Ａ（ｈｕｍａｎｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ２Ａ,ｈＢＭＰ２Ａ）ｃＤＮＡ３′端５６７个核苷酸插入表达载体ＰＳＧ４Ｔ－２中,在大肠杆菌中获得１５％的表达,表达产物为２１ＫＤ的蛋白质,经包涵体洗涤,尿素变性和复性后,取１ｉｎｇ表达产物,植入小鼠股四头肌中,２１天后取植入区进行组织切片观察,证实这种基因工程产物具有良好的异位骨诱导活性。     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。     

重组人骨形成蛋白-3成熟肽的表达、纯化及诱骨活性的研究*

推测人骨形成蛋白-3羧基端的127氨基酸的肽段为其成熟肽(hRMP 3m)。将编码此成熟肽的cDNA插入含PL启动子的表达质粒pDH中,构建表达质粒pDH-B-3m,转化大肠杆菌DH5α。42℃热诱导6h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白28％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后．溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在95％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白3成熟肽(rhBMP－3m)植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的rhBMP－3m具有明显的异位诱骨活性。     

人骨形成蛋白-2A与小鼠成骨细胞表面特异性结合的研究

作者证实在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-２Ａ（ｈＢＭＰ２Ａ）Ｃ端肽段具有骨诱导活性,再利用噬菌体呈现载体克隆并表达了ｈＢＭＰ２ＡｃＤＮＡ３’端５６７个核苷酸,表面呈现有人ＢＭＰ２ＡＣ端肽段的噬菌体与小鼠成骨细胞系（ＭＣ３Ｔ３）能够特异地结合,用抗Ｍ１３噬菌体抗体进行ＥＬＩＳＡ实验呈阳性反应,同时用^３ＨＴｄＲ参入重组ＢＭＰ２Ａ噬菌体时放射性计数比对照组高近１０倍,推测小鼠成骨细胞表面存在有人ＢＭＰ２Ａ受体。     

人骨形成蛋白2A活性片段在大肠杆菌中的高效表达

将编码人骨形成蛋白２Ａ（ＢＭＰ２Ａ）Ｃ端１７３个氨基酸（ＢＭＰ２３）和１３４个氨基酸（ＢＭＰ２４）的ＤＮＡ基因片段分别重组克隆进入ＰＬ启动子控制下的表达载体,构建了表达质粒ｐＢＬＢＭＰ２３和ｐＢＬＢＭＰ２４,分别转化大肠杆菌进行表达研究．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析温敏诱导的表达菌,可以分别观察到分子量为２０ｋＤ和１５．５ｋＤ的高表达条带,与理论计算的分子量一致,表达量分别占细菌蛋白质总量的１０％和２０％左右。表达产物经包含体制备达到８０％以上纯度。Ｎ端序列测定的１５个氨基酸,与重组ｃＤＮＡ基因编码的序列相同．ＢＭＰ２３和ＢＭＰ２４包含体经复性处理后,得到二聚体分子蛋白质条带,与骨基质胶原重组后在大鼠体内测活,观察到ＢＭＰ２３诱导软骨细胞生成,ＢＭＰ２４刺激丰富的骨样胶原组织合成．     

hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高,细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃ     

hBMP－2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５＇端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２。将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高;细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ后,细胞分泌产生的ＢＭＰ－２显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入ＢＭＰ－２重组质粒后,局部组织内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ转录水平也明显提高。     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

人骨形态发生蛋白7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究

目的:构建重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP7)表达质粒,并研究其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达。方法:将hBMP7重组表达质粒电转到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,并用DOT-BLOT和ELISA方法分析检测rhBMP7在重组CHO细胞中的表达。结果:hBMP7 cDNA整合到CHO细胞基因组中并被转录。点杂交和ELISA检测证实rhBMP7在CHO细胞中得到表达。结论:hBMP7成功在CHO表达系统中得到表达。     

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体pEC34中的一段寡核苷酸序列,其中包括翻译增强子序列、SD序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点,插入GST基因后,构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白2A(hBMP2A)和人骨形成蛋白3(hBMP3)C端肽段,将第一顺反子基因（GST基因）切小到原来的1／3时,则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。     

人骨形成蛋白3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化及其诱骨活性检测

为了在昆虫杆状病毒系统中表达人骨形成蛋白 3(humanbonemorphogeneticproteoin3,hBMP3) ,检测表达产物的诱骨活性 .将hBMP3全长cDNA 1416bp克隆入转移载体K8中 ,再与病毒DNA经脂质体包裹后转染昆虫细胞Sf9.重组病毒经蓝白筛选后 ,用PCR方法扩增目的基因片段进行初步鉴定 .收集重组病毒的转染上清 ,肝素亲和层析纯化目的蛋白 .SDS PAGE和Western印迹进一步鉴定此蛋白 .体外培养MC3T3 E1细胞 ,经目的蛋白刺激后 ,检测细胞内碱性磷酸酶 (ALP)活性 .并将目的蛋白进行小鼠体内肌肉包埋实验 ,检测其异位诱骨活性 .结果显示 ,肝素亲和层析可以收集 1个高的洗脱峰 .SDS PAGE显示 ,非还原型样本为 32kD的二聚体蛋白带和少量 16kD单体蛋白带 ;还原型样本仅有相应大小的单体蛋白带 ,纯度达 80 % .Western印迹在相应位置呈阳性染色 .此蛋白刺激小鼠成纤维细胞 4 8h后 ,胞内ALP的活性增高 ,经rhBMP3作用后的细胞MTT染色减弱 .在小鼠股部肌肉内包埋蛋白样品 2～ 3周 ,组织学检测有成骨组织生成 .说明hBMP3在此套系统中获得了表达 .表达产物在体外可以刺激成骨细胞的分化 ,却抑制细胞的增殖 .小鼠体内异位诱骨实验进一步证实表达产物具有成骨活性     

人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的Hbmp-2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程Hbmp-2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为102个氨基酸的Hbmp-2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达Hbmp 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :Hbmp 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比Hbmp 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。     

离子交换色谱法对大肠杆菌表达的人重组骨形态发生蛋白-7的纯化

带有BMP 7基因的大肠杆菌可以用来高量表达重组的人骨形态发生蛋白 7。升温诱导表达后 ,每升培养液大约可得到菌体湿重 3g ,其中目的蛋白约占菌体总蛋白量的 40 %。裂解离心 ,用低浓度变性剂洗涤初步纯化包涵体 ,上清中无目的蛋白损失 ,目的蛋白纯度提高到 60 %,将包涵体溶解于高浓度变性剂溶液中 ,然后在不同条件下用离子交换色谱法对变性状态下的蛋白质进行纯化 ,绝大部分杂蛋白被除去 ,目的蛋白纯度达 95 %以上 ,改变条件 ,可以减少rhBMP 7损失。并做Westernblot对目的蛋白进行特异性鉴定。     

表达外源rhBMP2的CHO细胞株稳定性分析

骨形态发生蛋白2(BMP2)属于TGF-β超家族,是诱导成骨活性最强的BMPs之一, 具有广泛的临床应用的前景。本实验室已成功构建高效表达rhBMP2的重组CHO细胞株, 现选取其中一株表达量最高的细胞rCHO(hBMP2)-C8进行长期体外培养, 并在培养过程中比较了添加和去除压力筛选中使用的MTX对细胞生长, rhBMP2基因拷贝数及rhBMP2分泌蛋白表达的影响;检测了该细胞株在无血清培养基中可以连续表达rhBMP2的时间以及培养基中rhBMP2的温度敏感性等等。该研究为进一步采用动物细胞规模化培养技术生产rhBMP2奠定了基础。     

人骨形态发生蛋白12对人骨肉瘤细胞的生物学作用

为研究人骨形态发生蛋白(human bone morphogenetic proteins,hBMP)12对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的作用,分别用hBMP12重组腺病毒(AdBMP12)以及含重组hBMP12(recombinant hBMP12,rhBMP12)的条件培养液干预人骨肉瘤细胞MG63和U2OS,利用台盼蓝拒染法、TUNEL法、吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)荧光双染法、Transwell小室和碱性磷酸酶活性测定法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移以及成骨分化能力的变化.与相应对照组相比,AdBMP12和含rhBMP12的条件培养液的干预致两种骨肉瘤细胞株细胞存活率降低,并呈一定的时间依赖性;凋亡率均随时间延长而增加,并且两种检测方法的结果一致;不同时间点的细胞穿膜数均明显减低;碱性磷酸酶活性在干预3d后开始逐渐增加,至第9d仍可观测到.以上差异均有统计学意义(P<0.01).提示无论是以腺病毒介导基因转入还是重组蛋白直接作用方式,hBMP12都可以抑制人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的增殖和迁移,并诱导其凋亡和向成骨细胞分化.     

人骨形态发生蛋白7（hBMP7）在毕赤酵母中的分泌表达

依据酵母密码子使用偏好性,利用重叠延伸PCR(OE-PCR)介导的定点突变方法,对人骨形态发生蛋白-7(human Bone Morphogenetic Protein-7,hBMP7)成熟肽编码序列进行改造,将毕赤酵母低频使用的精氨酸密码子CGG或CGA突变为高频使用的同义密码子AGA,明显提高了hBMP7成熟肽在毕赤酵母中的表达量摇瓶培养表达量为25.45mg/L,是改造前序列的4.6倍;TricineSDS-PAGE及Western-blotting结果表明,rhBMP7成熟肽分子量为18kD,以单体形式存在,具有良好的免疫原性;利用梯度浓度G418筛选到一株高拷贝整合的转化子,该转化子摇瓶表达量为45.45mg/L,约为单拷贝转化子的2倍。表达上清经阳离子交换介质SPSepharoseR○FastFlow纯化后,目的蛋白纯度达到90%。纯化后的样品与I型胶原混合冻干后埋植于小鼠股部肌袋内,能异位诱导间充质细胞分化形成软骨细胞。     

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatinC端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatinC端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET／mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatinC端片段的cDNA长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatinC端片段氨基酸的同源性为61％。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28％,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatinC端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E．coliBL21中高效表达。小鼠canstatinC端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。