猴免疫缺陷病毒（SIV）实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒（SIV）TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法RT—PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD—SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIVQPCR检测方法,质粒DNA模板在10’～10。拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3．26,相关系数为0．999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV％均小于1％。结论建立的SIVQPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）核酸拷贝量。     

荧光定量PCR检测土拨鼠肝炎病毒核酸方法的建立

目的建立土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）核酸的荧光定量PCR（Real-time PCR）检测方法,应用于土拨鼠肝炎病毒模型的研究。方法分别根据土拨鼠肝炎病毒核心抗原（WHcAg）和表面抗原（WHsAg）的DNA序列设计13对扩增引物,从中筛选无非特异性扩增及引物二聚体且灵敏度高的引物,用于土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测。建立感染土拨鼠肝炎病毒的土拨鼠血清中WHV核酸的Real-timePCR检测方法。结果根据WHsAg基因的5＇端设计的一对引物WHVSF1与WHVSR1,检测灵敏度可达1×101拷贝/μL,病毒拷贝数与Real-time PCR Ct值的标准曲线的R2值为0.997,且电泳未见明显非特异性条带及引物二聚体。结论建立了土拨鼠血清中WHV DNA的Real-time PCR检测方法,该方法为进一步研究土拨鼠肝炎病毒模型奠定了基础。     

HBV感染者外周血PBMC中TLR4 mRNA与病毒载量的相关性研究

目的探讨乙型肝炎病毒感染者外周血PBMC中TLR mRNA与乙肝病毒复制的相关性。方法采用逆转录PCR检测外周血单个核细胞（PBMC）中TLR4 mRNA的含量,实时荧光定量Real Time PCR的方法检测HBV DNA,进行相关性分析。结果不同病毒载量组（〈1×103copies/μg DNA,1×103copies/μg DNA〈且〈1×105copies/μg DNA,〉1×105copies/μg DNA）TLR4 mRNA水平差异具有显著性（P〈0.01）,HBV病毒载量的对数值与TLR4 mRNA的含量存在负相关（r=-0.537,P〈0.01）。TLR4 mRNA的相对表达量与患者的ALT、AST呈正相关（r=0.608、r=0.659,P〈0.01）。结论HBV在患者体内复制活跃、病毒载量增高与外周血单个核细胞TLR4mRNA的表达下调有关。     

13039例乙型肝炎患者血清HBV DNA水平流行病学分析

目的了解本地区近四年乙型肝炎患者HBV DNA阳性率与病毒载量分布特点。方法采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测2012年至2015年间13 039例HBsAg阳性患者HBV DNA载量,并进一步分析24例HBeAg阳性、31例HBeAg阴性初诊乙肝患者4年间接受正规治疗后HBV DNA变化趋势。结果本地区近4年间血清HBV DNA阳性率依次为48.6%、46.18%、38.69%、37.66%,呈逐年下降趋势,差异具有统计学意义(P0.01);各年度病毒载量均值的对数值分别为(5.48±1.56),(5.27±1.72),(5.29±1.68),(5.35±1.85)拷贝/mL。2013年、2014年、2015年分别与2012年相比,差异均有统计学意义(P0.01、P0.01、P0.05),而低病毒载量(即病毒拷贝数的对数值小于5拷贝/mL)患者比例2012年明显大于其他年份,2012年分别与2013年、2014年、2015年相比,差异具有统计学意义(P0.01,P0.01,P0.05);HBeAg阳性/阴性乙肝患者接受正规治疗后,其HBV DNA载量均呈逐年下降趋势,其中第一年下降显著(P0.01)。结论近4年本地区血清HBV DNA阳性率呈逐年下降趋势,且低病毒载量比例明显增加。     

PCR—ELISA检测HBV DNA的研究

目的：建立一种敏感、特异的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测方法。方法：应用PCR扩增技术和核酸杂交技术结合酶促显色技术（即PCR－ELISA技术）来检测血清中的HBV DNA。结果：应用PCR－ELISA技术能够检出许多PCR琼脂张胶电泳所检测不到的HBV DNA,大大地提高了检出率,而且,特异性强。结论：PCR－ELISA方法灵敏度高,行异性强,检测结果数据化,不受主观因素的影响。     

随机聚合酶链反应检测未知病毒方法学的建立

目的 探索并建立一种用于快速检测未知病毒的分子生物学方法。 方法 分别以乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）为假定的未知DNA、RNA病毒,验证随机聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）检测未知病毒的可行性。分离HBV、HCV的阳性血清,去除宿主DNA后,提取病毒核酸。锚定随机引物经Klenow酶处理（模板为DNA）或反转录酶作用（模板为RNA）退火至模板,随后用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增。扩增产物经纯化后克隆、测序,最后与BLAST进行比对。结果 经BLAST比对证实,插入序列中有HBV和HCV的基因组片段,在病毒拷贝数为1&;#61620;106拷贝/ml时,被检测克隆的阳性率约为15%。目前我们利用本法能达到的检测低限大致为1&;#61620;104拷贝/ml。 结论 成功建立了一种基于随机PCR的未知病毒检测方法,其优点在于不依赖病毒的细胞培养及其核酸序列信息。此种方法的建立为快速诊断不明原因疾病和新发传染病病原体提供了新的思路。     

重组8型腺相关病毒介导HBV急性感染树鼩模型建立

目的利用重组8型腺相关病毒介导1.3拷贝HBV基因组（1.3HBV,ayw亚型）在树鼩肝脏表达,建立HBV急性感染树鼩模型。方法通过大腿内侧静脉注射将携带有1.3 HBV的重组8型腺相关病毒（recombi-nant adeno-associated virus 8,rAAV8-1.3HBV）导入树鼩肝脏,通过ELISA检测树鼩血清中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb,荧光定量PCR检测树鼩肝脏和血清中HBV DNA,全自动生化分析仪检测血清中ALT水平,并观察感染后肝脏的病变情况。结果 HBV感染主要血清标志物1～2周内均检测阳性;30 d后肝组织仍可检测到病毒抗原阳性细胞;55 d时肝组织HBV DNA拷贝数仍可达到104～105;树鼩血清中HBV DNA拷贝数持续一个月高于正常组;肝组织炎细胞略增多,血清ALT水平持续升高。结论 rAAV8所携带的HBV基因组高效专一导入树鼩肝细胞并复制表达,成功建立HBV急性感染树鼩模型,为进一步探索rAAV8树鼩慢性感染模型打下一定的基础。     

VSD负压引流技术结合游离植皮治疗大面积皮肤缺损的 临床疗效研究

目的：探讨核苷类似物（NAs）拉米夫定（LAM）用药时间与乙型肝炎（cHB）患者体内HBV病毒血清HBV-DNA载量的关系。方法：选取214例HBeAg阳性患者,在LAM（100mg/d）的36个月用药治疗前使用实时荧光定量PcR进行血清HBV-DNA载量进行测定,并使用特异性引物鉴定HBV病毒DNA保守位点YMDD的抗药性突变以及病毒株的变化情况。结果：（1）214例患者均对LAM产生应答,在治疗12．18个月后血清HBV-DNA载量稳定在较低水平。（2）病毒株在NAs治疗前已经出现耐药性突变（18％）,用药加速了HBV病毒的耐药进化,18个月后耐药病毒数在214例样本中均超过10％的检测标准。结论：LAM治疗在9．18个月获得良好的治疗效果,建议24个月后停药更换临床处方防止耐药病毒株的进化。     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用

【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)能导致猪群高死亡率,从而造成严重的经济损失。因此,建立严密、高效的防控系统,包括灵敏、准确的诊断方法以及高效的预报预警机制等,以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而高灵敏度的ASFV微滴数字PCR(Droplet digital PCR,dd PCR)检测方法。【方法】针对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化,建立了ASFV实时荧光定量PCR(q PCR)和dd PCR检测方法;并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异性和重复性进行了评估,利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血清样本进行检测,血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检,评估不同方法检测结果的符合率。【结果】建立的ASFV q PCR和dd PCR检测方法线性关系较好(R2≥0.998),dd PCR的最低检测限度可达到0.36拷贝,在20μL反应体系中约为10拷贝/反应,检测灵敏度是q PCR的10倍。ASFV dd PCR检测方法具有很高的特异性和重复性,不与其他猪常见病毒发生交叉反应。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,可作为一种有效的分子生物学方法来诊断ASFV,为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供新的技术储备,同时促进dd PCR技术在我国的发展和应用。     

实时定量PCR在乙型肝炎(HBV)诊断中的应用

随着对乙型肝炎治疗的深入研究 ,对乙型肝炎病毒 (HBV DNA)数量的确诊显得尤其重要。本文采用RealTimeQuantitativePCR(简称RQ PCR)方法 ,对 2 84例经ELISA检定的乙型肝炎患者血清标本进行HBV DNA定量检测。结果有 96例HBsAg(+ ) HBeAg(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 10 0 % ,病毒平均量 5 0 2× 10 5拷贝 μl;87例HBsAg(+ ) HBeAb(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 4 4% (38例 ) ,病毒平均量 1 0 2× 10 3 拷贝 μl,5 3例HBsAg(+ ) HBcAb(+ )的血清标本RQ PCR阳性率为 5 8% (31例 ) ,病毒平均量 6 6 9× 10 4拷贝 μl;而 4 6例正常对照组经检测全为阴性。可见RQ PCR的检测结果反映了不同患者的病情 ,对乙型肝炎的诊断、治疗具有临床指导价值。     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

循环血游离Shope病毒DNA含量与兔VX2肿瘤18F-FDG PET/CT影像表现的相关性分析

目的:探讨循环血中Shope病毒DNA含量与兔VX2肿瘤18F-FDG PET/CT影像学特征间的关系及其临床意义。方法:采用组织块接种法建立兔VX2肿瘤模型,并行18F-FDG PET-CT观测肿瘤大小及糖代谢相关值,实时定量荧光探针PCR法检测肿瘤组织及血浆中Shope病毒特征性DNA片段含量。结果:移植前外周血中未检测出Shope病毒特异性DNA片段;移植后2周,VX2肿瘤组织和循环血中均可以检测到特征性Shope病毒DNA片段。瘤体内DNA含量明显高于循环血中含量。循环血Shope病毒DNA含量与FDG-PET的最大标准摄取值(SUVmax)明显呈正相关(r=0.943,p=0.005),但与肿瘤体积相关性尚不明确(r=0.657,p=0.156)。结论:循环血Shope病毒DNA有望作为一种潜在的VX2肿瘤标志物,其廉价、无创的特性,有望在肿瘤的早期诊断和预后随访中发挥优势。     

A competitor DNA template for the molecular quantification of the hepatitis B virus

The molecular determination of viral load in the serum represents the most valuable prognostic marker of HBV infection. In this paper, a new molecular assay for the quantitative measurement of HBV presence is described. It is based on PCR performing with a HBV-specific competitor DNA template. For the construction of the DNA template, a HBV DNA-originated 436 bp DNA fragment was modified by introducing a 110 bp deletion and cloned into pUC19. The resulting vector serves as the competitor DNA template in the competitive PCR. Post-PCR, the competitor DNA generates an amplified fragment of 306 bp; it could be easily distinguished from the product generated from the viral-originated DNA product (416 bp) when the same primers are used. The quantitative ratio between the two products enables the quantitative determination of viral load. The range of the HB-PCR assay is from 3 x 10(4)to 6 x 10(10) particles/ml. A serum HBV load determination performed by HB-PCR assay indicated a close correlation with the results of the Quantiplex HBV DNA assay (bDNA). The HB-PCR assay is cheap, reliable and easy to use in any laboratory working with PCR methods.     

Real-time PCR test for detection and quantification of human polyomavirus BK (BKV) DNA

The human polyomavirus BK (BKV) is wide-spread pathogen, associated with urogenital tract disorders or even nephropathy in immunosuppressed patients. Nowadays molecular detection by real-time PCR (qPCR) is recognized as a method-of-choice for detecting human polyomaviruses in clinical samples. The aim of the study was development of real-time PCR assay for detection and quantification of polyomavirus BK DNA in clinical samples, using specific primers targeting a viral DNA VP3 gene and a TaqMan hydrolyzing probe. The analytical sensitivity of assay was tested using serial dilutions of BKV DNA in range between 13500 and 15 copies/ml. 27 urine samples and 23 plasma samples taken from a group of 22 adult recipients of allogeneic HSCT were tested for the presence of polyomavirus BK in the LightCycler system. Described in-house real-time PCR assay detected BKV DNA in 8 specimens (6 urine and 2 plasma). Detected average viral load was 170 copies/ml for plasma and 1250 copies/ml for urine samples, respectively. The results of this study show that developed TaqMan-based probe qPCR assay is very reliable and valuable for detection and quantification of BKV DNA, both in urine and plasma samples. These data, combined with its rapid turnaround time for results and decreased hands-on time, make the LightCycler PCR assay highly suitable for the rapid diagnostics of polyomavirus BK infections in the clinical laboratory.     

Advantage of PCR for detecting low amounts of HBV DNA in patients' sera

Serum hepatitis B virus DNA (HBV DNA) is now the most important and reliable marker for monitoring viral replication. Quantitative detection of HBV DNA in serum is based on a commercial standardized solution hybridization assay (Genostics). In this work, we studied the sensitivity and specificity of this method, in comparison with the polymerase chain reaction (PCR) technique, for low-value HBV DNA serum samples. Fifty-four patients with or without HBV serological markers were divided into 4 groups according to their HBV DNA values.Genomic amplication was found to affect 2 conserved regions of the viral genome, the S and C regions. Samples with an HBV DNA concentration equal to or greater than 1.5 pg/ml were considered positive in the “Genostics” test. A total of 38% of patients considered negative in the quantitative assay (< 1.5 pg/ml) were found to be positive for HBV DNA in serum after PCR. Only 26% of patients with an HBV DNA concentration of between 1.5 and 10 pg/ml in the Genostics test had PCR-detectable viral DNA in serum. Some 56% of patients with HBV DNA values between 10 and 20 pg/ml were found to be positive after amplification. All patients whose HBV DNA values were above 20 pg/ml had PCR-detectable viral DNA in serum.Our PCR results suggest that the positive limit level of the Genostics test has to be re-evaluated. Indeed, for low values of HBV DNA (under 20 pg/ml and especially under 10 pg/ml), it is not possible to conclude about the positivity from the quantitative assay, and results have to be estimated according to the clinical and serological status of the patients. Moreover, PCR can be falsely negative because of methodological problems.Nevertheless, this study confirms that PCR does enable detection of the viral genome in HBV-seronegative patients and in “old” and “cured” HBV-infection marker carriers.     

美国白蛾核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立对昆虫核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus）进行定量检测方法,本研究选用美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒的polyhedrin基因为目的基因,经引物设计、PCR 扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品DNA进行检测,构建出美国白蛾核型多角体病毒SYBR GreenⅠ荧光定量标准曲线。统计学分析显示标准品浓度的对数值与Ct 值之间存在良好的线性关系（R=0.998）。该方法的检测灵敏度为10¹～10²拷贝/μL,线性范围达5个数量级,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间的变异系数均小于3%。根据已建立的方法对不同感染时间段的感病幼虫进行检测,每毫克幼虫样本内病毒polyhedrin基因拷贝数增殖倍数对数值与感染时间（d）呈正相关（R=0.987）。这些结果表明,建立的美国白蛾核型多角体病毒荧光定量 PCR检测方法是可靠的,具有灵敏度高、重复性好等特点,可为昆虫核型多角体病毒体内增殖动态研究及昆虫病毒的标准化生产提供参考。