应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是通过核酸片段对微生物群落进行研究,可以监测未培养细菌及其功能基因,被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析,并成为微生物分子生态学研究中的重要手段之一。文中论述了DGGE操作过程中遇到的常见问题,并提出了相应的解决方法。全面分析了样品预处理过程和PCR扩增效果对DGGE分析的影响,探讨了DGGE图谱的优化过程和图谱分析方法,并对DGGE的应用前景进行了综述。     

金堆城钼矿尾矿堆积区土壤细菌多样性分析

金堆城钼矿是我国目前最大的钼生产基地,钼矿的开采导致大量含有金属硫化物的尾矿堆积,使土壤及地下水环境发生了改变.为了解钼矿尾矿堆积后土壤微生物多样性的变化规律,分别采集5个不同时期堆积的尾矿土壤样品(S1～S5),应用16S rDNA V3区片段的变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析土壤细菌群落结构的变化.结果显示S1～S5的DGGE条带图谱差异很大,且各有其特征条带.堆积时间较短的S1、S2的多样性明显大于堆积时间长的S3、S4、S5.对DGGE图谱中优势条带序列进行分析,土壤样品中的优势细菌主要属于变形菌门(Proteobacterium)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)和一个未命名的菌种(Unidentified).本实验证实钼尾矿的堆积导致土壤细菌结构以及多样性发生改变,且多样性随着尾矿堆积时间的增加而减少;鉴定的优势菌种在微生物浸矿技术的发展和应用方面具有潜在的研究价值.     

长期不同施肥制度对潮棕壤微生物生物量碳、氮及细菌群落结构的影响

以沈阳生态站长期定位试验为研究平台,采用传统氯仿熏蒸方法和现代PCR-DGGE技术探讨了长期不同施肥制度对土壤微生物生物量碳和氮及细菌群落结构的影响.结果表明:在整个试验期,土壤微生物生物量碳和氮的动态变化趋势基本相同;长期施用有机肥可显著提高土壤有机碳和土壤微生物生物量碳和氮含量,而长期施用化肥明显降低土壤pH,土壤微生物生物量碳和氮含量也显著降低.DGGE图谱表明:不同施肥处理的细菌16S rDNA多数条带分布相同,28条带中有18条为共有条带,说明潮棕壤中细菌类群较稳定,但其数量受到施肥的影响;长期施用有机肥促进潮棕壤细菌群落结构的多样性,而施用化肥处理则降低了其多样性.     

接种微生物菌剂对猪粪堆肥过程中细菌群落多样性的影响

利用PCR-DGGE方法研究了接种外源微生物菌剂对鲜猪粪高温好氧堆肥过程中细菌群落多样性的影响.结果表明：接种外源微生物菌剂可以促进堆肥的顺利进行,比不接种处理的高温期提前2 d.DGGE图谱分析表明,堆肥中优势细菌群落组成发生了明显的更迭现象,不同堆肥时期细菌群落的Shannon-Wiener指数呈显著差异.目的条带克隆测序结果表明,整个堆肥过程Clostridium stercorarium subsp. thermolacticum sp.一直是优势菌属,不经培养细菌、Bacillus coagulans sp.、Clostridium thermocellum sp.在接种外源微生物菌剂处理的第10、16天成为优势菌属,不经培养的Firmicutes sp.和不经培养的 delta proteobacterium分别在未接种外源微生物菌剂处理堆肥发酵的第5天和第16天成为优势菌属.非优势菌属Ureibacillus thermosphaericus、不经培养的Silvimonas sp.出现在堆肥腐熟后期,不经培养的土壤细菌主要出现在堆肥初期和高温初期.UPGMC聚类分析表明,接种外源微生物菌剂明显影响了堆肥不同时期的细菌群落结构组成.堆肥化过程中细菌DGGE图谱主成分分析表明,细菌群落变化主要受外源接种微生物菌剂的影响.     

不同富集和分离培养条件下的含酚废水处理生物膜微生物群落结构与活性比较分析

采用Biolog和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术研究了不同苯酚浓度培养对焦化废水处理厂反硝化池生物膜样品中微生物群落结构和代谢类型的影响。DGGE结果表明, 不同浓度苯酚和不同培养方式富集培养后, 细菌16S rDNA的部分条带分布谱形发生改变, 还有部分条带只受到了苯酚浓度变化的影响; 富集培养过程中由于碳源组成相对焦化废水简单, DGGE条带所代表的优势微生物多样性有所降低。Biolog试验结果表明, 生物膜样本的细菌群落代谢能力最强; 低浓度苯酚富集后的样品能利用的底物碳源类型最丰富。对Biolog试验结果的主成分分析显示, 相同浓度苯酚富集培养后的细菌群落代谢功能多样性相似, 但从DGGE结果看出其结构组成产生了变化。富集培养使样品微生物群落的代谢功能发生改变, 低浓度的苯酚富集增加了群落中微生物的代谢类型。而不同条件获得的分离物其苯酚降解能力的初步分析也表明, 富集与分离条件对苯酚降解菌的分离能力和得到的菌株特性具有差别。     

茶园土壤微生物群落基因多样性

应用PCR技术,直接从土壤中抽提总DNA,扩增16S rDNA V3 片段,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析16S rDNA V3 片段的多态性,研究了杭州西湖梅家坞不同植茶年龄(8、50和90年)、不同利用方式(茶园、荒地和林地)的土壤微生物群落基因多样性.结果表明：不同植茶年龄和不同土地利用方式影响土壤微生物群落的基因多样性.荒地、茶园和林地土壤微生物群落基因多样性指数明显不同(P<0.05),其排列顺序为荒地>茶园>林地.不同植茶年龄的土壤中,50年茶园土壤的微生物群落基因多样性指数、微生物量碳和基础呼吸明显高于8年和90年茶园土壤(P<0.05).     

Biolog和PCR-DGGE技术解析施肥对德惠黑土细菌群落结构和功能的影响

试验采用Biolog和PCR-DGGE技术研究了不同施肥处理对吉林省德惠市黑土细菌群落结构和功能的影响.Biolog试验结果表明,单施有机肥处理的土壤细菌群落对底物碳源利用种类最多,代谢功能多样性最高;而施用化肥处理降低了土壤细菌群落代谢功能.DGGE图谱表明,不同施肥处理的土壤细菌16S rDNA多数条带分布相同,说明这些细菌类群在黑土中较稳定,在本试验中未受到施肥的影响,但也有一些特殊条带出现或缺失,施用化肥处理降低了土壤细菌群落结构组成多样性.对Biolog和DGGE试验结果的主成分分析显示,未施肥和单施有机肥处理的土壤细菌群落结构和功能相似,表明单施有机肥处理主要是增加了土壤微生物的总量,而对黑土细菌群落结构组成影响是次要的;单施化肥和半量有机肥 化肥处理的土壤细菌群落代谢功能多样性相似,但其结构组成产生了分离.研究表明化肥处理主要是影响到土壤中快速生长和富营养的细菌类群,施用化肥降低了这些细菌类群的代谢活性.     

新疆一号冰川土壤细菌多样性的研究

应用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术分离PCR扩增的16SrDNA来研究土壤微生物的多样性。直接从新疆一号冰川不同海拔高度的土壤样品中提取总DNA。用两套细菌通用引物分别扩增16SrDNA的V3和V6／V9高变区的特异性片段,PCR产物进行DGGE分析。PCR—DGGE图谱表明,PCR产物经DGGE检测到的条带清晰且分离效果好。结果表明,PCR—DGGE是一种快速研究微生物群落结构的有效方法。     

应用PCR-DGGE技术研究石莼、网地藻藻际微生物多样性

应用变性凝胶梯度电泳(PCR-DGGE)技术对石莼、网地藻藻际微生物多样性进行研究,并对其进行相似性、未加权聚类分析(UPGMA)及微生物多样性(Shannon)指数分析。结果表明,PCR-DGGE图谱显示,石莼、网地藻藻际微生物DGGE图谱有着明显的差异性,具体表现在条带数及密度值的不同。Quantity one图谱分析表明:石莼藻际微生物16S r RNA基因的V3区共分离得到25条DNA片段,网地藻为16条DNA片段。DGGE相似性及未加权聚类分析表明:网地藻藻际微生物间的相似性为77.78%,石莼藻际微生物细菌群落间的相似性为49.25%。Shannon指数分析表明,石莼藻际微生物多样性指数显著高于网地藻(P0.05)。石莼藻际微生物细菌群落较网地藻丰富。     

贵州红壤水稻土淹水培养过程中Fe-氢酶微生物的多样性

【目的】研究水稻土淹水培养过程中Fe-氢酶微生物的多样性,对于揭示Fe-氢酶微生物的群落演替规律和产氢微生物的生化代谢机理具有重要的意义。【方法】采用PCR-变性梯度凝胶电泳和实时定量PCR技术进行基于梭菌属Fe-氢酶基因的多样性和丰度的分析。【结果】水稻土淹水培养过程中Fe-氢酶基因的变性梯度凝胶电泳图谱显示,培养1-5 d时Fe-氢酶基因条带数增加,10 d时Fe-氢酶基因条带数减少,20-40 d时Fe-氢酶基因条带数再次增加并保持稳定,对应的含Fe-氢酶微生物的群落结构随着培养过程的进行发生了显著变化。主成分分析表明,1 d与20 d、5 d与10 d、30 d与40 d的含Fe-氢酶微生物群落结构相似性较高,随着培养时间的增长含Fe-氢酶微生物群落结构趋于稳定。α多样性指数分析显示,1 d和10 d的丰富度指数(R)、Shannon-Weaver指数(H’)、Simpson指数(DS)与其他时间点相比较小,说明这2个时间点的Fe-氢酶多样性低,对应的含Fe-氢酶微生物群落结构较为简单,表明淹水培养过程中微生物的群落结构发生了演替变化。变性梯度凝胶电泳指纹图谱15个Fe-氢酶的优势条带测序后构建的系统发育树表明,培养前期的优势条带与梭菌属的Fe-氢酶关系较近,培养后期出现了非梭菌属的Fe-氢酶。淹水培养过程中Fe-氢酶基因的拷贝数在106/g干土的水平,占细菌的相对比例为1‰–2‰。【结论】水稻土淹水培养过程中发现了4种梭菌属Fe-氢酶和3种非梭菌属Fe-氢酶基因,对应的含Fe-氢酶微生物在培养前期群落结构发生显著演替变化,培养后期趋于稳定。