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T7启动子作用下抗人TNF—α单链抗体的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
基因工程技术构建的抗人TNF-α单链抗体克隆人表达载体pET15b-Etag中,在T7启动子的作用下,经0.1mmol/L IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的38%,表达产物大部分以包涵体形式存在,而一小部分以有活性的可溶性形式出现于细菌的外周质中。 相似文献
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昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达尿激酶原* 总被引:2,自引:0,他引:2
在转瓶和2L搅拌反应器中,利用重组杆状病毒AcNPV感染sf9昆虫细胞表达尿激酶原。在转瓶中,细胞接毒密度1.2×106/mL、MOI=30时,尿激酶原活性达到1065IU/mL研究了尿激酶原表达过程中葡萄糖、乳酸的代谢变化。实验结果表明细胞状态对尿激酶原的表达水平有显著影响。 相似文献
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重组人尿激酶原的分离纯化及性质研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本文报道从人尿激酶原(pro-urokinase,pro-UK)基因重组工程菌E.coliJA221表达产物的复性液中纯化尿激酶原的方法。复性产物经Zn^2+选择性沉淀,尿激酶抗体亲和柱层析,benzamidine-Sepharose CL 4B亲和吸附,即得比活达110000IU/mg的纯化产品。样品经SDS-PAGE鉴定,在还原及非还原条件下,均表现为分子量为43kd的单一条带。动力学研究测得 相似文献
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以霍乱毒素B亚基(CTB)基因为载体,构建了含不同抗原表位的恶性疟原虫的融合基因CTB/ATE和CTB/AWTE。前者除含有恶性疟原虫裂殖子表面主要抗原表位杂合多肽基因SPf66外,还含有很强的T辅助细胞表位CST3和Tc细胞表位;后者在此基础上将我国发现的B细胞表位NKNDD基因经8次串联后融合其中。两种形式的融合基因经测序正确后转入大肠杆菌TK1046中,产量分别为10mg/L及5mg/L。表达产物CTB/AWTE经亲和层析纯化双抗夹心ELISA测定表明,该融合蛋白在保留了与抗CTB抗体结合的同时,与抗NKNDD单抗的结合效价达1:8000。 相似文献
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霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)的克隆及其表达 总被引:7,自引:0,他引:7
从霍乱弧菌中抽提基因组DNA,用PCER方法获取霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)。序列分析结果表明,CtxB基因编码124个氨基酸,其中编码62位Thr的密码子与文献报道有差异。将CtxB基因插入质粒pGEX-4T-2,构建pGEX-CTXB表达质粒,转化大肠相菌BL21(DE30,筛选表达菌株CTXB/BL21。工程株经IPTG诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经SDS-PAGE分析,融合蛋白分子 相似文献
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人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
从诱导的人胚肺细胞HFL株中提取总RNA.经RT-PCR反应获取了人GM-CSFcDNA,DNA序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用PCR改造了人GM-CSF的cDNA5’端核苷酸序列,并将改造的人GM-CSF基因插入含T7启动子的质粒pET-11d构建成表达质粒pETC-5,将此质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)得到表达菌株BLEC4。表达菌株用0.5mol/LIPTG诱导2小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。SDS—PAGE电泳图谱扫描结果表明,rhGM-CSF产量占菌体总蛋白量的16%。ELISA和TF-1细胞培养测定表明,初步纯化和复性的rhGM-CSF具有天然的hGM-CSF生物活性。 相似文献
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用无血清培养基在填充床生物反应器生产 rHuEPO 总被引:2,自引:0,他引:2
在填充床生物反应器用含5%FBS的DMEM:F12培养基培养产重组人促红细胞生成素(rHuEPO)的细胞C28~10d后,使用自制的无血清生产培养基(SFMp)生产rHuEPO。SFMp培养基既能维持细胞生长,又能生产EPO,也便于纯化分离rHuEPO。使用填充床生物反应器培养细胞,能维持培养20~25d,rHuEPO表达水平达12~28.4mg/L之间,反应器的产率达到71.0mg/L/d,比滚瓶的产率增加12~14倍。葡萄糖最高消耗量达到21g/L/d,细胞培养密度最高达到3.0×107/ml以上,每次可收无血清培养上清80~87L。由于细胞被固定在聚酯片上,培养上清中脱落细胞很少。观察了反应器的乳酸和氨的含量,其结果表明乳酸和氨含量分别低于3.5g/L和5mmol/L,不影响产物的表达。经过多批培养和生长rHuEPO的结果表明,自行配制的SFMp培养基在该反应器能有效地维持细胞生长和生产rHuEPO。 相似文献
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人Mn—SOD cDNA的克隆及高效表达 总被引:13,自引:0,他引:13
用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,扩增了人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)的cDNA。重组到T7启动子控制下的表达载体pET-24a(+)中,构建表爱质粒pET-MnSOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE及蛋白质印迹分析表明,经1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达一分子量为22kD的蛋白质,与抗人 相似文献
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用T—A载体克隆技术构建丙肝病毒C+E1区真核表达质粒pSVL—HC… 总被引:1,自引:0,他引:1
用BamHI和HindⅢ将丙肝病毒C+E1DNA片段从其克隆载体pGEM3zf-HCV/C+E1上切下,经Txq酶补齐3‘末端后插入到载体pSVL-T中,构建成丙肝病毒C+E1真核表达载体pSVL-HCV/C+E1。 相似文献
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采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150~156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450~500IU/106cell/24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa.绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。 相似文献
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将质粒pBX-MT上的小鼠MT-ⅠcDNA片段切下作为模板,通过PCR方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒pBS-SK中,经DNA序列测定后证明其克隆序列正确.再将MT-ⅠcDNA编码序列插入到转移载体pBacPAK8的BamHⅠ和EcoRⅠ位点之间,通过磷酸钙/DNA共转染方法将其导入昆虫细胞Sf9中,以Westernblot和DotEIA方法对表达产物进行了检测,表达量为1mg/L 相似文献
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人突变appE基因在转基因鼠体内的表达及血清脂质变化 总被引:3,自引:0,他引:3
为了研究人突变apoE7基因在血脂代谢中的作用.采用微注射的方法建立了人apoE7转基因鼠,三个首建鼠(tg1,tg2,tg3)整合目的基因的拷贝数相差2倍左右,其血中表达的人apoE7的水平也不相同,低水平表达的tg1为1.26mg/dl,高水平表达的首建鼠tg3血清中apoE7浓度可高达21.1mg/dl.异常apoE基因的表达导致了转基因鼠血清甘油三酯和胆固醇明显升高,为对照的1.5~3倍.高密度脂蛋白HDL降低,低密度脂蛋白LDL和极低密度脂蛋白VLDL升高.经20mmol/LZnSO4诱导后,F1代Tg3鼠系血清甘油三酯(TG)水平高达444mg/dl,胆固醇(TC)高达234mg/d1.HDL升高和LDL/VLDL降低十分明显,表现了高脂血症的指征. 相似文献
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用BamHI和HindII将丙肝病毒C+E1DNA片段从其克隆载体pGEM3zf-HCV/C+E1上切下,经Taq酶补齐3’末端后插入到载体pSVL-T中,构建成丙肝病毒C+E1真核表达载体pSVL-HCV/C+E1。本实验中重组效率达64.7%(11/17),正向插入为50%(2/4)。 相似文献
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点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
采用PCR分段克隆法将点状产气单胞菌点状亚种(Aeromonas puctata subsp.jpuctata)脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,apPEP)的编码区基因分成3段扩增并拼接成编码690个氨基酸的完整基因apPEP,将其克隆在表达载体pBL和pKKH上,构建成温度和IPTG诱导型高效表达apPEP的重组大肠杆菌BL21/pBL-PEP和BL21/pKKH-PEP 相似文献
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对酵母NMT基因在大肠杆菌中表达进行较详细的研究,进而构建了复制子为p15A并含卡那霉素抗性基因的相容性表达质粒pKZMT,将其与表达质粒pCZmCα1共转化进大肠杆菌BL21(DE3)F′,进行双质粒表达偶联加工修饰研究,其中pCZmCα1表达底物蛋白小鼠cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基α(PKA-mCα)。SDSPAGE及Westernblot分析表明,双质粒表达系统中,PKA-mCα都得到了稳定的高表达,尤其在23℃低温诱导表达时,表达产物的可溶性部分明显增多;而酵母NMT被控制在有利于活性功能的可溶性低水平表达。[3H]myristicacid标记测定及放射自显影的结果显示,在大肠杆菌中表达的重组PKA-mCα被豆蔻酰化修饰。 相似文献
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人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆,测序及表达 总被引:16,自引:1,他引:16
用逆转录聚合酶链反应(RTPCR),以人胎肝组织总RNA为模板,扩增了人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,ZnSOD)的cDNA,并进行序列分析,将该hCu,ZnSODcDNA重组到T7启动子控制下的分泌型表达载体pET22b(+)中,构建表达质粒pETSOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。SDSPAGE及蛋白质印迹分析表明,经1mmol/L异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达一分子量为19kD的蛋白质,与抗人SOD多抗有特异的免疫反应,表达量约为菌体总蛋白质的30%,具有特异性SOD酶活性,酶活力可达1797u/ml培基。 相似文献
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采用聚合酶链反应(PCR)技术和DNA体外重组方法,克隆出579bp的丙型肝炎病毒(HCV)NS4b基因片段,插入到原核高效表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET/NS4b,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析显示在30kD处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析(IMAC)纯化目的的蛋白,ELESA检测结果表 相似文献