HepG2.2.15细胞中联合应用siRNA抑制HBV复制和表达的研究

观察联合应用siRNA对HepG2．2．15细胞中HBV抗原表达和复制的抑制作用。应用ELISA方法检测HBeAg和HBsAg;HBVDNA水平用实时定量PCR测定;用RT—PCR检测HBVmRNA水平。结果显示,实验中应用的HBV特异性siRNA均具有明显的抗HBV抗原表达和病毒复制作用;联合应用siRNA较单独应用具有更强的抗HBV作用。可见,HepG2．2．15细胞中联合应用siRNA对HBV复制的抑制作用比单独应用siRNA更有效。     

高复制HBV转基因小鼠模型对抗病毒药物拉米夫定评价的研究

[目的]探讨乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠模型筛选抗HBV药物的可行性。[方法]用公认抗HBV复制药物拉米夫定对我们建立高复制HBV转基因鼠进行实验,选我们建立的1.3copy高复制HBV转基因小鼠20只,随机分成两组,每组10只。采用灌胃针灌胃法给药。对照组灌喂生理盐水,实验组灌喂拉米夫定,剂量为100mg/kg,每天2次,连续灌21d,每7d采血1次。荧光定量PCR检测血清中HBVDNA。[结果]实验组用拉米夫定前小鼠血清HBVDNA5.50±0.42(拷贝数log10数值),3周后HBVDNA已显著降低(4.63±0.57),4周后,小鼠血清HBVNDA为4.08±0.51,停药1周后,再次检测血清HBVDNA,小鼠血清HBVDNA又恢复正常水平(5.70±0.39)。[结论]我们建立的高复制HBV转基因小鼠模型验证了拉米夫定对HBV复制的抑制程度和持续时间,表明该模型可应用于抗HBV药物的筛选、评价研究。     

microRNA在乙型肝炎病毒感染及相关疾病中的作用

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种嗜肝性DNA病毒,感染后可导致急性和慢性肝炎,而慢性感染是导致肝硬化、肝癌和肝衰竭的主要病因。在乙型肝炎病毒复制、转录和相关疾病进程中,microRNA(miRNA)扮演着重要的角色。乙型肝炎病毒感染肝细胞后能引起细胞内microRNA表达谱的改变:一方面,microRNA能促进乙型肝炎病毒的转录和诱导宿主细胞向肿瘤细胞转化;另一方面,microRNA也能抑制乙型肝炎病毒包装和复制。重要的是,乙型肝炎病毒的感染能影响宿主血清microRNA的表达。因此,这类特殊的microRNA今后可成为乙型肝炎病毒相关疾病诊断的潜在生物标记物。将对乙型肝炎病毒与宿主microRNA之间相互作用及其相关生物学效应作一综述。     

微小RNA-1调解乙型肝炎病毒复制和肝细胞分化

微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一种高度保守的非编码小RNA,参与调节各种细胞过程。病毒可以利用细胞中的miRNA增加其在宿主细胞中的复制。迄今为止,miRNA在乙型肝炎病毒(HBV)复制过程中的作用还知之甚少。该研究中,大量miRNA拟态随着HBV复制被转染入肝癌细胞系。该研究注意到MicroRNA-1(miR-1)转染后导致HBV复制明显增加,并伴随HBV转录上调、抗原表达及子代分泌。然而,生物信息学和荧光素酶报告分析显示,miR-1可能不是直接以HBV基因组为靶点,而是通过调控宿     

锤头状核酶在HepG2.2.15细胞内的抗HBV特性

乙型肝炎病毒 (HBV)C基因区的 3′端序列在HBV各亚型中是高度保守的 ,它编码的多肽链都富含精氨酸 ,同时与前基因组RNA的包装和病毒DNA的复制有关。因此 ,HBV中C基因的 3′端保守区是核酶介导的抗病毒研究的理想靶位点。针对上述位点设计了锤头状核酶RzC ,同时作为对照 ,设计了相应的突变型核酶dRzC。HepG2 .2 .15细胞系是由头尾相接的HBVayw亚型基因组转染肝癌细胞系HepG2而建立的一株能稳定分泌HBV各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系。因而用HepG2 .2 .15细胞进行核酶的抗病毒研究更接近于疾病的治疗过程。为此 ,把体外转录的核酶RzC和dRzC以及核酶表达载体pCRzC和 pCdRzC直接转染HepG2 .2 .15细胞。初步结果表明 ,体外转录的核酶RzC对HBV复制的抑制很弱 ,这可能是由于核酶在细胞内快速被RNA酶降解造成的 ;而通过内源性传递产生的核酶RzC能够明显地抑制HBV的复制。结果说明 ,锤头状核酶RzC在HepG2 .2 .15细胞内显示抗病毒感染的能力 ,有可能作为HBV基因治疗的一种手段     

乙型肝炎病毒急性感染小鼠模型的建立

采用高压水注射方法,通过尾静脉将具有复制能力的HBV质粒导入BABL/cJ小鼠体内,应用real-time PCR、ELISA、RIA、Southern Blot、Northern Blot,以及免疫组化等方法,检测小鼠病毒血症、血清和肝组织中HBV 抗原表达动态变化、肝组织中HBV转录和复制情况,以及小鼠免疫应答状况。结果HBV基因可以在小鼠体内表 达和复制,并诱导小鼠产生特异性免疫应答,其应答模式及HBV清除过程与人类的HBV急性感染类似。实验显 示高压注射具有复制能力的HBV质粒可以在小鼠体内建立HBV急性感染模型,这种模型可以用于HBV病毒 学、免疫学以及抗病毒药物筛选等方向的研究。     

蒽醌对HBV稳定产毒细胞株HepAD38HBV DNA复制的抑制作用

目的对掌叶大黄乙醇提取物中天然成份-蒽醌类化合物的抑制乙肝病毒（HBV）的活性进行检测。方法制备掌叶大黄乙醇提取物（RPE）并从中分离提取有效成份,荧光定量PCR法和ELISA法检测PRE及其各成份对HepAD38细胞中HBV表达及复制的作用;同时用MTY法检测细胞毒性。结果从掌叶大黄乙醇提取物中分离得到的大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖甙对HBVDNA复制以及抗原表达均有明显的抑制活性。同时MTY法检测显示大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖甙没有明显毒副作用。结论大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖甙可以有效抑制HBVDNA复制及HBsAg表达,对其进一步的研究将有助于在此化合物基础上开发出新的抗HBV药物。     

新疆维吾尔族与汉族乙型肝炎患者HBVDNA 及肝功能检测结果的比较

目的:探讨新疆乌鲁木齐地区伴有肝功能指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)浓度异常的维吾尔族(维族)及汉族HBeAg阳性乙型肝炎初次就诊患者,乙型肝炎病毒DNA复制载量及ALT浓度是否存在差异及其对患者诊断、预后的意义。方法:回顾性选取门诊伴有ALT浓度异常的汉族、维族初次就诊患者并筛选出HBeAg阳性患者汉族、维族共373例。采用实时荧光定量聚合酶链反应、生化测定及酶联免疫吸附试验法分别测定HBV DNA、ALT浓度及乙肝HBeAg。结果:(1)汉族HBV DNA组秩和8869,维族HBV DNA组秩和10359.36,经Mann-Whitney Test检验两组间尚不能肯定HBVDNA分布有统计学意义,即伴有肝功能损害的汉族、维族初次就诊HBeAg阳性患者HBV DNA复制程度没有差异。(2)汉族ALT组秩和26818.50,维族ALT组秩和22009.50,经Mann-Whitney Test检验两组间ALT分布有统计学意义,即伴有肝功能损害的初次就诊HBeAg阳性患者汉族肝功能损害程度高于维族。(3)HBVDNA低复制组(103-104copy/mL):汉族秩和3771.46,维族秩和4993.2;中复制组(104-106copy/mL):汉族秩和6412.4,维族秩和5088.2;高复制组(>106copy/mL):汉族秩和929.04,维族秩和666.96,经Mann-Whitney Test检验在低复制组两民族间ALT分布无统计学意义,在中、高复制组两民族间ALT具有统计学意义。即:伴有肝功能损害的初次就诊HBeAg阳性患者在HBV DNA低复制组两民族间肝功能损害程度无差异,但在中、高复制组汉族肝功能损害程度高于维族。结论:新疆乌鲁木齐地区伴有肝功能损害的初次就诊的HBeAg阳性的汉族与维族之间HBV DNA的病毒复制无统计学意义(P>0.05),但两民族间的ALT具有统计学意义,可能跟维族的民俗、饮食习惯及生存环境、免疫相关基因HLA基因频率分布差异等因素有关。     

bm47基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制及转录的影响分析

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bm47基因普遍存在于已测序的鳞翅目核型多角体病毒基因组中,是杆状病毒的核心基因之一,但其在病毒复制及转录过程中的具体功能尚未可知。本研究利用Red重组技术在大肠杆菌BW25113中构建了BmNPV的bm47基因缺失型病毒bm47-ko-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了bm47基因的补回型病毒bm47-re-Bacmid。然后利用TCID50病毒滴度测定法和荧光定量PCR等方法研究了缺失bm47基因对病毒复制、转录及蛋白表达的影响。结果表明,bm47基因缺失后对病毒基因组的复制水平没有明显的影响;在病毒转染BmN细胞后48h和72h两个时相,bm47基因的缺失导致病毒早期基因lef3、晚期基因vp39以及极晚期基因p10的转录水平均有一定程度的下降。本研究工作将为深入研究BmNPV bm47在病毒复制和基因转录过程中的生物学功能奠定基础。     

乙型肝炎病毒急性感染小鼠模型的建立

采用高压水注射方法,通过尾静脉将具有复制能力的HBV质粒导入BABL/cJ小鼠体内,应用real-timePCR、ELISA、RIA、Southern Blot、Northern Blot,以及免疫组化等方法,检测小鼠病毒血症、血清和肝组织中HBV抗原表达动态变化、肝组织中HBV转录和复制情况,以及小鼠免疫应答状况.结果HBV基因可以在小鼠体内表达和复制,并诱导小鼠产生特异性免疫应答,其应答模式及HBV清除过程与人类的HBV急性感染类似.实验显示高压注射具有复制能力的HBV质粒可以在小鼠体内建立HBV急性感染模型,这种模型可以用于HBV病毒学、免疫学以及抗病毒药物筛选等方面的研究.     

KNK437抑制乙型肝炎病毒复制及转录

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)在肝细胞内复制过程中,病毒反转录酶(P蛋白)与前基因组RNA(Pregenomic RNA,pgRNA)上的RNA包装信号ε形成P-ε复合物,启动反转录合成和核衣壳装配。封闭P-ε相互作用是一种极具吸引力的抗HBV策略。已知P-ε形成RNP复合物正常发挥活性时,需要热休克蛋白(Heat-shock proteins,Hsps)参与。本研究探索Hsps抑制剂KNK437对HBV复制及转录的影响。主要运用了三种工作模型:HepG2.2.15细胞系、瞬时转染1.05×HBV(pCH9-3091)质粒的Huh7细胞系和瞬时转染1.3×HBV(pGEM-1.3×HBV)质粒的Huh7细胞系。采用CCK-8方法检测KNK437的细胞毒性,ELISA测定细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平;q-PCR和qRT-PCR分别检测细胞内HBV核衣壳中DNA和细胞内HBV RNA水平;Western blotting检测细胞内衣壳亚单位(core)表达水平;qRT-PCR检测细胞内Hsps本身的转录水平。结果表明:20μM KNK437对细胞没有毒性,且在该浓度下KNK437除HepG2.2.15模型外,均下调HBV HBsAg和HBeAg的胞外分泌,抑制细胞内HBV核衣壳中DNA合成,降低细胞内HBV RNA转录水平,最低可使DNA水平降至1.5%左右,RNA水平降至30%左右,从而表明KNK437抑制HBV复制和转录。在HepG2.2.15中的Western blotting显示,KNK437明显减少细胞内衣壳亚单位(core)表达水平。KNK437也抑制Hsp70,Hsp90b,Hsp40等三种热休克蛋白RNA的转录,从而验证了它的确是一种泛Hsps抑制剂。本研究结果显示KNK437具有潜在抗HBV应用前景。     

多种小分子干扰RNA联合抑制乙型肝炎病毒的体外研究

小分子干扰RNA(siRNA)能够在哺乳动物细胞中引起包括病毒基因在内的基因沉默。为了研究多种siRNA联合应用在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制中的效果,本研究设计了12种针对不同HBV靶点的siRNA,转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG22.2.15细胞,并采用了酶联免疫法检测上清液中HBsAg和HBeAg的含量,实时定量PCR法检测细胞中HBV的DNA含量。结果发现这12种分子均能在不同程度上抑制病毒复制。进一步研究表明它们对HBV的抑制作用在一定程度上存在剂量效应和协同作用,单分子siRNA在80nmol/L处对HBsAg和HBeAg的抑制率分别可达到约80%和60%,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对HBsAg就能达到90%的抑制率,但对HBeAg表达的抑制率提高不明显。单分子siRNA在80nmol/L处对HBVDNA复制的抑制率可达到90%以上,而多分子siRNA组合在20nmol/L处对DNA含量就能达到约90%的抑制率。本研究的结果为进一步开发新的联合应用多种siRNA治疗HBV的途径打下了基础。     

多种小分子干扰RNA联合抑制乙型肝炎病毒的体外研究

小分子干扰RNA(siRNA)能够在哺乳动物细胞中引起包括病毒基因在内的基因沉默。为了研究多种siRNA联合应用在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制中的效果,本研究设计了12种针对不同HBV靶点的siRNA,转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG22．2．15细胞,并采用了酶联免疫法检测上清液中HBsAg和HBeAg的含量,实时定量PCR法检测细胞中HBV的DNA含量。结果发现这12种分子均能在不同程度上抑制病毒复制。进一步研究表明它们对HBV的抑制作用在一定程度上存在剂量效应和协同作用,单分子siRNA在80nmol／L处对HBsAg和HBeAg的抑制率分别可达到约80％和60％,而多分子siRNA组合在20nmol／L处对HBsAg就能达到90％的抑制率,但对HBeAg表达的抑制率提高不明显。单分子siRNA在80nmol／L处对HBVDNA复制的抑制率可达到90％以上,而多分子siRNA组合在20nmol／L处对DNA含量就能达到约90％的抑制率。本研究的结果为进一步开发新的联合应用多种siRNA治疗HBV的途径打下了基础。     

乙肝病毒DNA检测药盒在汉通过鉴定

乙肝病毒(HBV)引起的乙型肝炎是人们普遍关注的传染病,目前一般采用血清学方法进行临床检测。中国科学院武汉病毒研究所分子病毒室用α~(32)P—dCTP标记克隆化的HBVDNA片段作分子杂交探针,制备检测药盒,研究HBVDNA在人血清、体液和组织中存在的状态。以HBVDNA作为传染性的指标比血清学方法更为直接可靠。该药盒不需特殊试剂和设备,能在一般科研、医疗、卫生和防疫等部门应用。两年     

APOBEC3A通过脱氨基作用抑制HBV复制

目的:研究APOBEC3A抑制HBV复制的分子机制。方法:首先在肝癌细胞HuH7中过表达APOBEC3A,通过MTT法检测了APOBEC3A对细胞毒性的影响;通过免疫荧光检测了APOBEC3A在细胞中的定位,通过IP试验进一步证实了APOBEC3A与病毒颗粒的相互作用;并通过ELISA,特异性荧光定量PCR检测了HBV复制的参数包括上清中HBsAg,病毒核心颗粒中HBV DNA以及核内的cccDNA的表达水平;最后通过3D PCR方法分析了核心颗粒中HBV DNA脱氨基作用。结果:过表达APOBEC3A对HuH7细胞毒性没有显著性差异;APOBEC3A主要位于细胞核,但APOBEC3A可以与病毒颗粒结合,在逆转录环节对HBV复制发生抑制作用;共转染HBV复制质粒和APOBEC3A表达质粒后,细胞上清中HBsAg,核心颗粒中的HBV DNA以及核内的cccDNA均显著下降;最后通过3D PCR和克隆测序表明核心颗粒中的HBV DNA负链发生了大量的G-A突变,同时正链也发生了较多的C-T突变。结论:APOBEC3A可与病毒颗粒结合,在HBV复制的逆转录环节可作用于HBV单链,发生脱氨基作用,从而抑制HBV的复制。     

干扰素在肝癌细胞Huh7.0中诱导SAMHD1抑制HBV复制

目的:研究干扰素调节宿主限制性因子SAMHD1的表达而抑制HBV复制的分子机制。方法:首先不同剂量的干扰素α、β和γ处理Huh7. 0细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测SAMHD1在转录和翻译后的表达水平;进一步通过siRNA干扰内源性的SAMHD1,再评价干扰素α、β对病毒的抑制效应;最后通过免疫荧光检测了干扰素α诱导内源性SAMHD1的细胞定位及Southern blot检测了SAMHD1细胞定位对病毒复制的影响。结果:在Huh7. 0细胞中,SAMHD1的RNA水平和蛋白表达明显受干扰素α和β的诱导升高;干扰SAMHD1后干扰素α和β对HBV复制的抑制作用消失; SAMHD1定位在细胞核内,干扰素α诱导SAMHD1同样定位在细胞核内,缺失核定位信号后SAMHD1丧失了其抑制病毒复制的作用。结论:在Huh7细胞中,干扰素α、β能诱导SAMHD1表达上调来抑制HBV的复制,SAMDH1的抗病毒作用依赖于其细胞定位。     

新型二氢嘧啶类化合物的合成及其抗乙型肝炎病毒活性研究

以芳香氰基化合物为起始原料,经胺解、乙酰化、催化氢化、关环等步骤得到新型二氢嘧啶类化合物14个,结构通过核磁共振氢谱、质谱、元素分析确证,并利用HepG2.2.15细胞进行了体外抗HBV活性评价.结果表明部分化合物具有明显的抗HBVDNA复制作用,其中化合物5c和5n抑制HBVDNA复制的半数有效浓度分别为0.87μmol/L和0.67μmol/L.初步探讨了活性化合物的构效关系,同时运用分子排阻色谱法考察了活性化合物与病毒衣壳蛋白的相互作用.     

体外针对X基因的小干扰RNA的抗乙型肝炎病毒效应研究

目的：探讨体外针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因的小干扰RNA（siRNA）对HBV复制和抗原表达的抵制作用。方法：利用siRNA表达框架法设计针对HBVX基因的siRNA,转染HepG2．2．15细胞,RT-PCR半定量检测转染前后X基因的表达;ELISA法测定各组24、48、72hHBsAg和HBeAg的含量;荧光定量PCR检测48h时HBVDNA的变化。结果：制备了HBVX基因的siRNA,转染后24、48和72h,HBVX基因mRNA的量分别减少了57％、78％和40％;siRNA能抑制HBsAg和HbeAg的分泌,抑制高峰在48h,抑制率分别为42％和43％;荧光定量PCR证实HBVDNA的复制亦受到抑制。结论：针对HBVX基因的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

肝硬化患者乙肝表面抗原的定量检测及意义

目的：探讨HBsAg定量测定在乙肝相关性肝硬化病程中的变化和意义。方法：选择乙肝相关性肝硬化患者60例纳入实验对象,根据2000年9月（西安）第10次全国病毒性肝炎学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准分为代偿期组和失代偿期组,其中代偿期组35例,失代偿期组25例。另选取20例乙型肝炎病毒携带者作为对照组。应用电化学发光免疫分析法测定患者血清中HBsAg和HBeAg滴度,免疫荧光定量PCR法检测HBVDNA载量。结果：对照组、肝硬化代偿期组和肝硬化失代偿期组HBsAg滴度分别为：2574.73±3252.27COI、5494.35±2129.84COI和6921.25±1957.60COI,三组之间差别均有统计学意义（P〈0.05）。肝硬化代偿期组中,HBsAg滴度与HBVDNA、HBeAg水平呈负相关性（P〈0.05（）r=-0.350;r=-0.514）。肝硬化失代偿期组中,HBsAg滴度与HBVDNA及HBeAg水平均无明显相关性（r=-0.020;r=0.154）。结论：肝硬化失代偿期HBsAg滴度明显高于肝硬化代偿期,代偿期HBsAg滴度高于HBV携带者组,即HBsAg滴度随肝脏疾病进展呈阶梯型递增。肝硬化代偿期,HBsAg滴度与HBVDNA、HBeAg水平呈负相关性,HBsAg水平可以作为评估病毒复制的参考指标。肝硬化失代偿期,HBsAg滴度与HBVDNA和HBeAg无相关性,不能反映病毒复制水平,不能作为评估病毒复制的参考指标。     

肝硬化患者乙肝表面抗原的定量检测及意义

目的:探讨HBsAg定量测定在乙肝相关性肝硬化病程中的变化和意义。方法:选择乙肝相关性肝硬化患者60例纳入实验对象,根据2000年9月(西安)第10次全国病毒性肝炎学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准分为代偿期组和失代偿期组,其中代偿期组35例,失代偿期组25例。另选取20例乙型肝炎病毒携带者作为对照组。应用电化学发光免疫分析法测定患者血清中HBsAg和HBeAg滴度,免疫荧光定量PCR法检测HBVDNA载量。结果:对照组、肝硬化代偿期组和肝硬化失代偿期组HBsAg滴度分别为:2574.73±3252.27COI、5494.35±2129.84COI和6921.25±1957.60COI,三组之间差别均有统计学意义(P<0.05)。肝硬化代偿期组中,HBsAg滴度与HBVDNA、HBeAg水平呈负相关性(P<0.05()r=-0.350;r=-0.514)。肝硬化失代偿期组中,HBsAg滴度与HBVDNA及HBeAg水平均无明显相关性(r=-0.020;r=0.154)。结论:肝硬化失代偿期HBsAg滴度明显高于肝硬化代偿期,代偿期HBsAg滴度高于HBV携带者组,即HBsAg滴度随肝脏疾病进展呈阶梯型递增。肝硬化代偿期,HBsAg滴度与HBVDNA、HBeAg水平呈负相关性,HBsAg水平可以作为评估病毒复制的参考指标。肝硬化失代偿期,HBsAg滴度与HBVDNA和HBeAg无相关性,不能反映病毒复制水平,不能作为评估病毒复制的参考指标。