Oxydation von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in Rhodospirillum rubrum

Zusammenfassung Es wird die 25–30 fache Anreicherung einer löslichen NADH-Dehydrogenase [NADH: (acceptor) oxidoreductase, EC 1.6.99.3.) aus R. rubrum durch Gelfiltration an Sephadex G 200 und Chromatographie an DEAE-Cellulose beschrieben. Das Enzym ist bei DEAE-Cellulosechromatographie nur in Gegenwart von FMN oder NADH stabil. Menadion, Ferricyanid, DCPIP, p-Benzochinon und Cytochrom c sind als Elektronenacceptoren wirksam. Cytochrom c ist ein schlechter Acceptor. Das pH-Optimum der Reaktion liegt bei 8,4. Km für NADH ist 3,0 · 10^-5 m. NADPH wird nur mit etwa 3–5% des Wertes von NADH umgesetzt. Die prosthetische Gruppe des Enzyms ist FMN, Km für FMN ist 0,3 · 10^-7 m. Das Enzymprotein wird bei Verdünnung in 0,05 m Puffer inaktiviert; FMN und FAD sowie NADH und NADPH haben einen stabilisierenden Effekt. Durch höhere Pufferkonzentrationen wird das Enzym zunehmend inaktiviert. Die Inaktivierung besteht in einer Labilisierung oder Abspaltung der prosthetischen Gruppe vom Enzymmolekül. Verschiedene Metalle inaktivieren das Enzym ebenfalls.

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Oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide in Rhodospirillum rubrum I. Characterization of a soluble NADH dehydrogenase

Summary A soluble NADH^* Dehydrogenase [NADH: (acceptor) oxidoreductase, EC 1.6.99.3.] has been purified 25–30 fold from R. rubrum by gelfiltration with Sephadex G 200 and ionexchange chromatography on DEAE-Cellulose. During the second purification step the enzyme is stable only in the presence of either FMN or NADH. Electronacceptors which were found to be effective include menadione, ferricyanide, DCPIP, p-benzoquinone and cytochrome c, the latter substance being a poor acceptor. The optimum pH of the reaction is at about 8.4. Km for NADH is 3.0×10^-5 m. NADPH is oxidized at only about 3–5% the rate of NADH. The active prosthetic group of the enzyme is FMN with an appearant Km of 0.3×10^-7 m. When diluted in 0.05 m buffer the enzyme becomes rapidly inactivated. FMN, FAD and also NADH and NADPH exhibit a stabilizing protective effect. Higher concentrations of buffer cause increasing inactivation. The mechanism of the inactivation is thought to be a labilization or detachment of the prosthetic group from the enzyme molecule. Several metals also inactivate the enzyme.

     

Eigenschaften der NAD-spezifischen Hydrogenase aus Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Aus zellfreiem Extrakt von Hydrogenomonas H 16 wurde die lösliche Hydrogenase 45 fach bis zu einer spezifischen Aktivität von 36500 E/g Protein angereichert. Das Enzym katalysiert die Reduktion von NAD mit molekularem Wasserstoff. Ein Cofaktorbedürfnis konnte nicht festgestellt werden. Der Einfluß von NADH, ATP, Bicarbonat und Magnesium auf die hydrogenasekatalysierte NAD-Reduktion war unerheblich. Das angereicherte Enzym ist flavin- und pyridinnucleotidfrei und reagiert mit NAD, nicht mit O₂, NADP, FMN, FAD oder Methylenblau. Die drei letztgenannten Wasserstoff-Acceptoren werden lediglich in Gegenwart katalytischer Mengen NAD reduziert. Die lag-Phase der Reduktion von NAD läßt sich durch Vorinkubation des Enzyms mit NADH oder Wasserstoff, nicht jedoch mit NAD eliminieren. Die Hemmung der Hydrogenasereaktion durch Sauerstoff ist gering. Reduzierende Agenzien wie Mercaptoäthanol oder Sulfid setzten die Reaktionsrate herab.Die Michaeliskonstante der löslichen Hydrogenase für molekularen Wasserstoff beträgt K _m ^H2 =1,9·10^–4 M. Die NAD-Konzentration, bei der halbmaximale Aktivität erreicht wird, beträgt [NAD]_{0,5 (V)}=1,3·10^–4 M. Das pH-Optimum wird in 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer bei pH 8,5 und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer bei pH 7,9 erreicht. Unter den angegebenen Bedingungen lag das Temperatur-Optimum bei 36°C. Die Aktivierungsenergie der löslichen Hydrogenase wurde als 10,4 kcal/mol ermittelt.

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Properties of the NAD-Specific Hydrogenase from Hydrogenomonas H 16

Summary A soluble hydrogenase from cell-free extracts of Hydrogenomonas H 16 has been purified 45-fold up to a specific activity of 36,500 units per g protein. The enzyme catalyzes the reduction of NAD with molecular hydrogen. It does not require cofactors. The NAD-reduction catalyzed by this enzyme is influenced to only a small extent by the presence of NADH, ATP, bicarbonate or magnesium ions. The enzyme is free from flavins and pyridine nucleotides, reacts only with NAD and not with oxygen, NADP, FMN, FAD or methylene blue. FMN, FAD and methylene blue are reduced only in the presence of catalytic amounts of NAD. The lag-phase of the reduction of NAD can be eliminated by preincubating the enzyme in the presence of NADH or molecular hydrogen; NAD is ineffective. The inhibition of the hydrogenase reaction by oxygen is negligible. Reducing agents such as mercaptoethanol or sulfide decreased the reaction rate.The Michaelis constant of the soluble hydrogenase for molecular hydrogen is K _m ^H2 =1.9·10^–4 M. Half maximal activity is attained at a NAD-concentration of [NAD]_{0.5 (V)}=1.3·10^–4 M. The pH-optimum is 8.5 in 0.05 M potassium phosphate buffer and 7.9 in 0.05 M Tris-HCl-buffer; reaction rates were maximal at 36°C under the conditions employed. The activation energy was calculated to be 10.4 kcal/mol.

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Abkürzungen E Enzymeinheit (mole Substrat/min) - E _x Extinktionsänderung bei der Wellenlänge x nm - Ext._x Extinktion bei der Wellenlänge x nm - KP Kaliumphosphat (KH₂PO₄-K₂HPO₄-Gemisch) - MB Methylenblau - NAD Nicotinamid-adenin-dinucleotid - NADH reduziertes - NAD; TEAE Triäthylaminoäthyl - Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan     

Enzyme der Elektronentransportpartikel aus Rhodospirillum rubrum: Eigenschaften von NADH- und Succinat-Cytochrom c-Reduktase

Zusammenfassung Es werden einige Eigenschaften von NADH- und Succinat-Cytochrom c-Reduktase aus R. rubrum beschrieben. Beide Aktivitäten sind ausschließlich in der durch Ultrazentrifugation erhaltenen Partikelfraktion lokalisiert. Aerob im Dunkeln und anaerob im Licht gezüchtete Zellen zeigen keine Unterschiede in ihren spezifischen Aktivitäten.Das Optimum der Reaktion liegt für beide Aktivitäten bei 8,3; das von Succinatdehydrogenase bei 7,7. K _Mfür NADH ist 7,1·10^-6 m, für succinat 1,1·10^-4 m. NADPH wird nicht umgesetzt. Die Partikel zeigen unterschiedliche Affinität zum Elektronenacceptor Cytochrom c. K _Mfür Cytochrom c bei NADH 9,5·10^-6 m, bei Succinat 4,5·10^-6 m.NADH-Cytochrom c-Reduktase wird durch Verdünnung inaktiviert. Durch Serumalbumin kann das Enzym nur begrenzt geschützt werden. Das Substrat und der Acceptor sind wirkungslos.Succinat und Fumarat, jedoch nicht Malonat inaktivieren Succinat-Cytochrom c-Reduktase, wenn das Enzym in verdünntem Zustand vorliegt. Die beiden Substanzen zeigen unterschiedliche Inaktivierungskinetik. Serumalbumin bewirkt hier weitgehenden Schutz des Enzyms.Succinat-Cytochrom c-Reduktase wird durch Phosphat aktiviert.NADH- und Succinat-Cytochrom c-Reduktase werden durch steigende Phosphatkonzentrationen verschieden stark gehemmt.Detergentien (Triton X-100) inaktivieren beide Aktivitäten; NADH-Cytochrom c-Reduktase ist sehr viel empfindlicher als die Succinat-oxydierende Aktivität.Inhibitoren des Elektronentransports wirken auf beide Aktivitäten. NADH-Cytochrom c-Reduktase wird besonders durch Rotenon stark gehemmt.Succinat-Cytochrom c-Reduktase wird durch Malonat, Fumarat und durch Oxalacetat gehemmt. Oxalacetat ist bei R. rubrum ein sehr starker Inhibitor.

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Enzymes of the electron transport particles of Rhodospirillum rubrum: Properties of NADH- and succinate-cytochrome c-reductase

Summary Some properties of NADH- and succinate-cytochrome c-reductase from R. rubrum are described. Both activities are predominantly located in the particlefraction obtained by ultracentrifugation. No differencies in specific activities of the enzymes are observed between aerobic darkgrown and anaerobic lightgrown cells.The optimum pH of both reactions is at 8,3, the optimum for Succinicdehydrogenase at 7.7. K _M for NADH is 7.1×10^-6 m, for succinate 1.1×10^-4 m. NADPH is not oxidized. The particles also show different affinities for the electronacceptor cytochrome c. K _Mfor cytochrome c with NADH 9.5×10^-6 m and with succinate 4.5×10^-6 m.NADH-cytochrome c-reductase is inactivated by dilution. Serumalbumine can protect the activity to a limited extent. Substrate and acceptor are without effect.Succinate and fumarate but not malonate inactivate succinate-cytochrome c-reductase, when the enzyme is in a diluted form. Succinate and fumarate exhibit different kinetics of inactivation. There is a large protection by serumalbumine against the inactivation.Succinate-cytochrome c-reductase is activated by phosphate.Increasing concentrations of phosphate inhibit NADH- and succinate-cytochrome c-reductase to a different degree.The activities also show different sensitivities to inactivation by treatment with detergents (Triton X-100), NADH-cytochrome c-reductase being much more sensitive than succinate-cytochrome c-reductase.Inhibition of both activities by inhibitors of the electron transport chain is observed, notably a strong inhibition of the NADH-enzyme by low concentrations of rotenone.Succinate-cytochrome c-reductase is inhibited by malonate, fumarate and also by oxalacetate. In R. rubrum the latter substance is a potent inhibitor.

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Verwendete Abkürzungen NADH reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid - DCPIP 2,6-Dichlorphenol-indophenol     

Oxydation von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in Rhodospirillum rubrum

Summary An active form of ApoNADH Dehydrogenase [NADH: (acceptor) oxidoreductase, EC 1.6.99.3] from R. rubrum can be obtained by incubating the apoenzyme at 20° C without flavin. Subsequent lowering the temperature to 0° C decreases the activity to the original level. The whole process can be repeated.The addition of flavin stabilizes the active form, so that no decrease is observed after the temperature has been dropped to 0° C. Here FMN is 30–40 times more effective than FAD. The activated apoenzyme, containing FMN, is again the normal functional form of NADH Dehydrogenase, showing its properties.It is assumed, that during the preparation of the apoenzyme the prosthetic group is not removed from the proteinmolecule but is altered in its binding to or in its position at the molecule. This leads to an equilibrium between a form of low and of higher activity of the apoenzyme, which, by changing the temperature, can be shifted to either side.It is possible to remove the prosthetic group still present at the apoenzyme by dialysis or by gelfiltration with Sephadex. The resulting protein can now be activated only in the presence of flavin.

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Oxydation von reduziertem Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid in Rhodospirillum rubrum II. Über eine reversible, temperaturabhängige Aktivierung der ApoNADH-Dehydrogenase

Zusammenfassung Das Apoenzym der NADH-Dehydrogenase [NADH: (acceptor) oxidoreductase, EC 1.6.99.3.] aus R. rubrum kann durch Inkubation bei 20° C ohne Flavin in eine aktive Form übergeführt werden. Durch Absenken der Temperatur auf 0° C wird die wenig aktive Form wiederhergestellt. Der gesamte Vorgang kann beliebig wiederholt werden.Flavin stabilisiert die aktive Form, so daß bei Wechsel der Temperatur auf 0° C keine Abnahme der Aktivität mehr eintritt. Dabei hat FMN etwa 30–40fach größere Wirksamkeit als FAD. Das aktivierte, FMN enthaltende Apoenzym ist wieder die normale funktionsfähige Form der NADH-Dehydrogenase und zeigt deren Eigenschaften.Es wird vermutet, daß bei der Herstellung des Apoenzyms die prosthetische Gruppe in ihrer Bindung oder Lage am Enzymmolekül verändert, jedoch nicht abgespalten wird. Daraus resultiert der Zustand eines durch Temperaturwechsel verschiebbaren Gleichgewichtes zwischen einer wenig aktiven und einer aktiven Form des Apoenzyms.Die noch am Apoenzym befindliche prosthetische Gruppe kann durch Dialyse oder Gelfiltration mit Sephadex entfernt werden. Das Apoenzym ist jetzt nur noch bei Zusatz von Flavin aktivierbar.

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Verwendete Abkürzungen NADH reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid - FMN Flavinmononucleotid - FAD Flavin-adenin-dinucleotid     

Die Phenoloxydasen des AscomycetenPodospora anserina

Zusammenfassung Die Tyrosinase der Mutantezonata (z) vonPodospora anserina wurde untersucht. Die Mutante erzeugt im Vergleich zum Wildstamm große Mengen Tyrosinase.z ist eine morphologische Mutante mit rhythmischen Wuchs. Das Genz liegt auf dem rechten Arm der Koppelungsgruppe II und hat einen Abstand von 46 Kartierungseinheiten vom Centromer.Die Reinigung des Enzyms erfolgte durch Präzipitation mit Protaminsulfat, Ammoniumsulfat und anschließende Säulenchromatographie an DEAE-Sephadex und Hydroxylapatit. Die Einheitlichkeit des gereinigten Enzyms wurde in der Ultrazentrifuge und der Elektrophorese festgestellt. Das gereinigte Enzym ist in verdünnter Lösung instabil.Im Konzentrationsbereich von 2–15 mg/ml hat die Tyrosinase eine Sedimentationskonstante vons _20,w ⁰ =6,04. Die Molekulargewichtsbestimmung aus Diffusion und Sedimentation und aus dem Sedimentationsgleichgewicht nachYphantis ergab in demselben Konzentrationsbereich ein Molekulargewicht um 100.000. Bei einer Enzymkonzentration von 0,04 mg/ml fanden wir mit der Gelfiltrations-methode nur ein Molekulargewicht von 42.000. Aus diesen Resultaten läßt sich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen an anderen Tyrosinasen aus Pilzen eine konzentrationsabhängige Assoziation und Dissoziation des Enzyms folgern.Der Kupfergehalt beträgt 0,214±0,008%. Das gereinigte Enzym hat ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und eine Schulter bei 290 nm und von 320 bis 380 nm.Das Verhältnis von Dehydrogenierungen an Brenzcatechin zu Hydroxylierungen an Hydrochinon konnte polarographisch bestimmt werden. Es läuft im Mittel auf zwei Dehydrogenierungen nur eine Hydroxylierung ab. Natriumazid wirkt als reversibler und kompetitiver Inhibitor der Dehydrogenierungsreaktion.Im Rohextrakt liegt das Enzym in einer latenten Form vor. Es sind nur 10–20% der späteren Aktivität nachzuweisen. Das Enzym wird im Verlauf der Reinigungsprozedur oder durch Temperaturbehandlung (10 min bei 60°C) aktiviert. Der Aktivierungsvorgang ist von einer Veränderung der elektrophoretischen Beweglichkeit des Enzyms begleitet. Latentes und aktives Enzym unterscheiden sich nicht in ihrem Sedimentationsverhalten.

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The phenoloxidases of the ascomycetePodospora anserina IV. Purification and properties of tyrosinase

Summary Tyrosinase of the mutantzonata (z) ofPodospora anserina was investigated. In comparison to the wild strain the mutant (z) produces large quantities of tyrosinase.z is a morphological mutant with rhythmic growth. The genez is localized on the right arm of linkage group II at a distance of 46 map-units from the centromere.The enzyme was purified by precipitation with protamine-sulphate and ammonium sulphate and by subsequent column-chromatography on DEAE-Sephadex and hydroxylapatite. The homogeneity of the purified enzyme was checked by ultracentrifugation and disc-electrophoresis. The purified enzyme is unstable in dilute solution.At a concentration of 2–15 mg/ml the tyrosinase has a sedimentation constant ofs _20,w ⁰ =6.04. The determination of molecular weight from sedimentation and diffusion constants and from sedimentation-equilibrium according toYphantis showed a molecular weight of approximately 100,000 in the same concentration range. At an enzyme concentration of 0.04 mg/ml we found a molecular weight of only 42,000 using the gel-filtration technique. From these results, in accordance with the results obtained from other tyrosinases in fungi, association and dissociation of the enzyme dependent on concentration may be concluded.The copper content reaches a level of 0.214±0.008%. The purified enzyme has an absorption maximum at 280 nm and a shoulder at 290 nm and from 320 to 380 nm.The quotient of catechol-dehydrogenations to hydroquinone-hydroxylation was determined polarographically. The mean ratio is two dehydrogenations to only one hydroxylation. Sodium azide acts as a reversible and competitive inhibitor of the dehydrogenation-reaction.In the crude extract the enzyme is found in a latent form. Only 10–20% of its later activity can be demonstrated. The enzyme is activated in the course of the purification procedure or by temperature treatment (10 min at 60°C). The activation process is accompanied by a change in the electrophoretic mobility of the enzyme. Latent enzyme and active enzyme do not differ in their sedimentation behaviour.

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Mit Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft     

Purification and Characterisation of Rat Kidney Glutathione Reductase

Glutathione reductase [GR, E.C.1.8.1.7] catalyses NADPH dependent reduction of glutathione disulfide (GSSG) to reduced glutathione (GSH). Thus, it is the crucial enzyme to maintain high [GSH]/[GSSG] ratio and physiological redox status in cells. Kidney and liver tissues were considered as a rich source of GR. In this study, rat kidney GR was purified and some of its properties were investigated. The enzyme was purified 2,356 fold with a yield of 16% by using heat-denaturation and Sephadex G25 gel filtration, 2′,5′-ADP Agarose 4B, PBE94 column chromatographies. The purified enzyme had a specific activity (Vm) of 250 U/mg protein and the ratio of absorbances at wavelengths of A ₂₇₃/A _463, A ₂₈₀/A ₄₆₀, A ₃₆₅/A ₄₆₀, and A ₃₇₉/A ₄₆₃, were 7.1, 6.8, 1.2 and 1.0, respectively. Each mol of GR subunit bound 0.97 mol of FAD. NADH was used as a coenzyme by rat kidney GR but with a lower efficiency (32.7%) than NADPH. Its subunit molecular weight was estimated as 53 kDa. An optimum pH of 6.5 and optimum temperature of 65 °C were found for rat kidney GR. Its activation energy (Ea) and temperature coefficient (Q₁₀) were calculated as 7.02 kcal/mol and 1.42, respectively. The Km_(NADPH) and kcat/Km _(NADPH) values were found to be 15.3 ± 1.4 μM and 1.68 × 10⁷ M⁻¹ s⁻¹ for the concentration range of 10-200 μM NADPH and when GSSG is the variable substrate, the Km_(GSSG) and the kcat/Km_(GSSG) values of 53.1 ± 3.4 μM and 4.85 × 10⁶ M⁻¹ s⁻¹ were calculated for the concentration range of 20–1,200 μM GSSG.     

Biochemische Untersuchungen über das proteolytische Enzym des Darmsaftes von Helix pomatia L.

Zusammenfassung Die Verfasserin hat mit der biochemischen Duspiva-Methode eine kaseinspaltende Tätigkeit im Darmsaft von Helix pomatia nachgewiesen. Das proteolytische Enzym wirkt bei p_H 4 optimal. Es wird durch Glutathion, Cystein und Ascorbinsäure aktiviert, aber durch Cystin, Kaliumeisencyanid, Bleinitrat, p-Chloromercuribenzoat und o-Jodosobenzoat gehemmt.Die von diesen beiden letzten Stoffen hervorgerufene Hemmung ist durch Glutathion und Ascorbinsäure umkehrbar. Daraus schließt die Verfasserin, daß die Protease des Darmsaftes von Helix pomatia zu den sulfhydrylischen Enzymen gehört; sie nimmt an, daß dieses Enzym nicht nur von der Mitteldarmdrüse, sondern auch vom Darmkanal kommt.     

Studies on a bacteriolytic enzyme of Archangium violaceum (Myxobacteriales)

Summary The bacteriolytic enzyme which is released by Archangium violaceum into the growth medium was purified 650-fold by precipitation with acetone, followed by fractionated precipitation with acetone and chromatography with Sephadex G200. The fractionation with gel chromatography separated three proteolytic enzymes from one with bacteriolytic activity. The bacteriolytic enzyme has a pH optimum of 6 in universal buffer, is more stable in the alkaline than in the acidic region, and has an optimal activity in 0.025M Tris-buffer at pH 7.1. The lytic activity of the enzyme against Micrococcus lysodeikticus is stimulated by low concentrations of certain bivalent cations and decreased by higher concentrations of the same reagents. The activity is inhibited by EDTA. p-Mercuribenzoic Acid and N-acetyl-glucosamine have no influence on the activity. The kinetics of the reaction follow the law of Michaelis and Menten, is of zero order reaction, and the activation energy of the rate determining step is 10.7 kcal.

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Zusammenfassung Das bakteriolytische Enzym, das aus der Nährlösung von Archangium violaceum isoliert wurde, konnte durch Aceton-Fällung, fraktionierte Aceton-Fällung und Chromatographie an Sephadex G-200 650 fach gereinigt werden. Bei der Fraktionierung durch Gelchromatographie wurde gezeigt, daß 3 proteolytische Enzyme, neben dem bakteriolytisch aktiven, an die Nährlösung abgegeben werden. Das bakteriolytische Enzym hat ein pH-Optimum in Universalpuffer bei pH 6, ist im alkalischen Bereich stabiler als im sauren und hat eine optimale Aktivität in 0,025M Trispuffer pH 7,1. Die lytische Aktivität gegenüber Micrococcus lysodeikticus wurde durch geringe Konzentrationen von Erdalkali-Ionen erhöht und durch höhere Konzentrationen derselben Ionen erniedrigt. EDTA verringerte die lytische Aktivität während p-Mercuribenzoesäure und N-Acetylglucosamin ohne Einfluß auf dieselbe waren. Die Reaktionskinetik folgt dem Gesetz von Michaelis u. Menten und ist in Übereinstimmung mit einer Reaktion nullter Ordnung. Die Aktivierungsenergie des geschwindigkeitsbestimmenden Schrittes beträgt 10,7 kcal.

     

Kleine Beiträge zur Bestimmung des IEP von Protoplasten

Zusammenfassung Neben einer Würdigung des mikro-kataphoretischen Verfahrens für die gestellte Aufgabe wird zuerst eine Übersicht über die Untersuchungsapparatur, über die zu beachtenden Fehlerquellen und über die benutzten Untersuchungsobjekte und ihre Behandlungsweise gegeben. Das Verfahren von L.Michaelis wird hinsichtlich der Elektroden durch Vorschläge von J.Gicklhobn und K.Umrath, hinsichtlich der Mikrokammer durch Verwendung des E.Busch'schen Durchfluß-Objektträgers zu verbessern gesucht.Die praktischen Versuche ergeben für die nackten Protoplasten vonSolanum nigrum den IEP bei einer C_H von 1,6·10^–5 oder wenig darunter, für jene vonVitis vinifera in der Zone zwischen 6,3·10^–5 und 2,5·10^–5. Der gesuchte Wert wird für die Stachelkugeln der beidenNitella- Arten nach zwei verschiedenen Untersuchungsweisen übereinstimmend zu 1,6·10^–5 bis 3,2·10^–6 angenommen, während er bei der untersuchten untergärigen Rasse vonSaccharomyces cerevisiae zwischen 1,6·10^–5 und 2,2·10^–5 liegen dürfte.Die Diskussion führt zu einer knappen Übersicht über die möglichen Beladungsursachen der Objekte und untersucht kurz die Anwendbarkeit des Kataphoreseversuches für weitere Ziele der Protoplasmaforschung (analytisch-chemischer Aufbau der Objekte, ihre intrazelluläre C_H, Ladungswert der Protoplasten).Fortsetzung aus Protoplasma,11, 85–96;12, 268–278;14, 83–90, 90–96.     

Orientierende Untersuchung über das Verhältnis von CO2-Aufnahme zu Transpiration bei fortschreitender Bodenaustrocknung

Zusammenfassung Die CO₂-Aufnahme und die Transpiration an der Pflanze belassener Zweige vonlangsam austrocknenden eingetopften Ölbäumchen (Olea europaea ssp. sativa) wurden synchron mit URAS gemessen und zueinander ins Verhältnis gesetzt (P/T-Quotient).Unter den gegebenen Versuchsbedingungen (30 000 Lux Beleuchtungsstärke, 25–26° C, Evaporation nachPiche 0,35 cm³/Std, 350 ppm CO₂) hat sich mit zunehmender Wasserverknappung zweimal ein Zustand besonders wasserökonomischer Assimilation (hoherP/T-Quotient) ergeben: Erstmals bei Wassersättigung und später bei deutlich erschwerter Wasserversorgung. Das ersteP/T-Maximum kam bei Transpiration und CO₂-Aufnahme durch weit offene Stomata zustande, wenn also die Diffusion von Wasserdampf und CO₂ mehr durch die Außenfaktoren gesteuert wird als durch den stomatären Diffusionswiderstand (vgl.Stålfelt 1935,Koch 1957,Gaastra 1959, 1962). Die Höhe dieses erstenP/T-Gipfels gilt daher — auch relativ betrachtet — ausschließlich für die Faktorenkonstellation des Versuchs (das ist verhältnismäßig niedrige Evaporation, gekoppelt mit kräftiger Beleuchtung) und man muß sich besonders hier vor Verallgemeinerung hüten. Das zweiteP/T-Maximum trat während der hydroaktiven Spaltenschlußphase auf. Jetzt beschränkt in erster Linie der stomatäre Diffusionswiderstand die Transpiration und den CO₂-Einstrom; man darf daher erwarten, daß diesem zweiten Anstieg desP/T-Quotienten eher allgemeine Bedeutung zukommt.Mit 1 TextabbildungDie vorliegende Untersuchung wurde im Forstbotanischen Institut München ausgeführt. Besonderen Dank schulde ich Herrn Prof. Dr.B. Huber für die großzügige Erlaubnis, in seinem Institut zu arbeiten. Herrn Dr.W. Koch und Herrn OberpräparatorJ. Hey danke ich herzlich für Beratung und Hilfe beim Betrieb der Meßeinrichtungen. Für wertvolle Unterstützung durch die Botanischen Anstalten der Universität München danke ich Herrn Prof. Dr.L. Brauner. Dem Personal des Botanischen Gartens München danke ich für die sorgsame Pflege meiner Versuchspflanzen.     

Über den Sproßaufbau und die Blattentwicklung bei der Kartoffel

Zusammenfassung Auf Grund vergleichender entwicklungsgeschichtlicher Untersuchungen werden morphologische Termini für eine Reihe oberirdischer Pflanzenteile der Kartoffel begründet. Unter Bezugnahme auf Abb.₃ soll der Sproßaufbau nochmals erläutert werden. Die vegetative Achse ist sympodial zusammengesetzt. Jeder Sproßabschnitt endet mit einem Blütenstand, der durch den Fortsetzungstrieb (S₁) aus der Achsel des obersten Laubblattes (L _n–I ) seitlich verdrängt wird. Das letzte Blatt (L _n ) ist als laubblattartiges Hochblatt zu bezeichnen. Es ist das Tragblatt eines reproduktiven Sprosses, der mit der Mutterachse konkauleszent verwachsen ist und die Bildung eines wickeligen Teilblütenstandes einleitet. Eine zweite Partialinfloreszenz bildet sich tragblattlos unmittelbar unterhalb der Endblüte. Jede Wickel setzt sich aus Wickelästen zusammen, deren Basalabschnitte die Wickelachse aufbauen. Das freie Ende wird zum gegliederten Blütenstiel. Bisweilen auftretende Blättchen innerhalb der Infloreszenz sind Vorblätter von Blütenbeiknospen (V). Das Hochblatt (L _n ) und das oberste Laubblatt (L _n–I ) sind ferner Tragblätter von Beiknospen (B₁ und B). Die übrigen Laubblätter entwickeln Achselsprosse mit Vorblättern, die gegenüber Laubblättern stark reduziert sind. Der Fortsetzungstrieb beginnt mit zwei laubblattartigen Vorblättern (a und b) und endet nach Ausbildung einer Reihe Laubblätter wiederum mit einer Infloreszenz. Die Laubblätter sind unpaar gefiedert. Ferner treten Zwischenfiedern (primäre, sekundäre usw.) auf. Deren Stellung ist verschieden. Zwischen Vor- und Laubblättern existieren enge morphologische Beziehungen.Mit 11 Textabbildungen     

1-Naphthol 2-hydroxylase from <Emphasis Type="Italic">Pseudomonas</Emphasis> sp. strain C6: purification,characterization and chemical modification studies

1-Naphthol 2-hydroxylase (1-NH) which catalyzes the conversion of 1-naphthol to 1,2-dihydroxynaphthalene was purified to homogeneity from carbaryl-degrading Pseudomonas sp. strain C6. The enzyme was found to be a homodimer with subunit molecular weight of 66 kDa. UV, visible and fluorescence spectral properties, identification of flavin moiety by HPLC as FAD, and reconstitution of apoenzyme by FAD suggest that enzyme is FAD-dependent. 1-NH accepts electron from NADH as well as NADPH. Besides 1-naphthol (K _m, 9.1 μM), the enzyme also accepts 5-amino 1-naphthol (K _m, 6.4 μM) and 4-chloro 1-naphthol (K _m, 2.3 μM) as substrates. Enzyme showed substrate inhibition phenomenon at high concentration of 1-naphthol (K _i, 283 μM). Stoichiometric consumption of oxygen and NADH, and biochemical properties suggest that 1-NH belongs to FAD containing external flavomonooxygenase group of oxido-reductase class of enzymes. Based on biochemical and kinetic properties, 1-NH from Pseudomonas sp. strain C6 appears to be different than that reported earlier from Pseudomonas sp. strain C4. Chemical modification and protection by 1-naphthol and NADH suggest that His, Arg, Cys, Tyr and Trp are at or near the active site of 1-NH.     

Threonin-Desaminase aus Arthrobacter Stamm 23

Zusammenfassung Aus dem neu isolierten Arthrobacter Stamm 23 wurde Threonin-Desaminase 11fach angereichert. Das Enzym ist in einem Isoleucin, Pyridoxalphosphat, EDTA und Dithioerythrit enthaltenden Phosphatpuffer von pH 7,9 bei 4° C mehrere Tage lang ohne Aktivitätsverlust haltbar.Für das Enzym wurden Substratsättigungskurven ermittelt, die in Abwesenheit von Isoleucin hyperbolisch, in Gegenwart des negativen Effectors Isoleucin sigmoid verliefen. Der Hill-Koeffizient von n=1,95 deutet auf zwei substratbindende Zentren am Enzymprotein hin. Isoleucin verändert nur den K _m-Wert, beeinflußt aber nicht die maximale Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms.Das Enzym wird nicht nur durch Isoleucin, sondern auch durch Valin, Norvalin, Norleucin und im geringen Maße auch durch Leucin und -Aminobuttersäure gehemmt. Kurzkettige Aminosäuren wie Alanin oder -Aminoisobuttersäure hemmen das Enzym auch in hohen Konzentrationen nicht. Die Hemmkinetiken mit Isoleucin, Valin, Norvalin und Norleucin verlaufen sigmoid. Die Hill-Koeffizienten deuten auf zwei Bindungsstellen für alle Inhibitoren hin. Antagonistische Effekte zwischen Isoleucin und Valin oder den anderen negativen Effectoren waren nicht zu beobachten. Aus den kinetischen Daten war weiterhin zu schließen, daß die negativen Effectoren Valin, Norvalin und Norleucin an den gleichen Bindungsstellen des Enzymes angreifen wie Isoleucin.Das Enzym läßt sich durch Entzug seiner Effectoren inaktivieren. Eine Reaktivierung gelingt mit Isoleucin, Valin und Threonin und den möglichen Kombinationen dieser Aminosäuren.

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Threonine deaminase from Arthrobacter strain 23

Summary Threonine deaminase (l-threonine hydro-lyase [deaminating], EC 4.2.1.16) has been partially purified (11-fold) from Arthrobacter strain 23 isolated recently in this laboratory. The enzyme is rather labile in the crude extract and in the partially purified state; in phosphate buffer pH 7.9 containing isoleucine, pyridoxal phosphate, EDTA and dithiothreitol at 4°C it can be kept for several days without loss of activity.The enzyme yielded substrate saturation curves which were hyperbolic unless the inhibitor isoleucine was present. Sigmoid saturation curves were obtained in the presence of isoleucine. The Hill-coefficient of n=1.95 indicates the enzyme to contain two substrate binding sites. Isoleucine changes the K _m-value, but does not influence the maximal reaction velocity of the enzyme.The enzyme is not only inhibited by isoleucine, but also by valine, norvaline, norleucine and at a minor degree by leucine and -aminobutyric acid. It is not inhibited by alanine or -amino-isobutyric acid, even at high concentrations. Substrate saturation curves determined in the presence of isoleucine, valine, norvaline, and norleucine are sigmoid. The Hill-coefficients indicate the enzyme to contain two binding sites for the inhibitor. Antagonistic effects between isoleucine and valine or the other negative effectors have not been observed. From the kinetic data it can furthermore be concluded that the same binding sites are used by the negative effectors isoleucine, valine, norvaline, and norleucine.When being deprived of its effectors the enzyme becomes inactivated. A reactivation occurs when the enzyme is incubated in the presence of isoleucine, valine, or threonine or combinations of these amino acids.

     

Nitrate reductase from yeast: cultivation,partial purification and characterization

Summary Several yeast strains were assayed for occurence of nitrate reductase after growth in a defined medium with nitrate as the sole nitrogen source, Candida boidinii DSM 70026, showing the highest specific activity, was further investigated. The procedures for yeast fermentation and nitrate reductase purfication are described in detail. Nitrate reductase from this yeast was characterized as NAD(P)H: nitrate oxidoreductase (E.C.1.6.6.2). The enzyme activity with NADH (NADPH) was highest at pH 7.0 (7.1) and 30° C (25° C). The values of K _m determinations with NADH/NADPH were both 4 × 10^–4 mol/l; values for the substrate inhibition constant (K _i) were 6 × 10^–4 mol/l. The molecular mass of the native enzyme was estimated by gel permeation chromatography to be approximately 350 kDa. Offprint requests to: R. Gromes     

Untersuchungen über das Transportsystem für Thiamin bei Bacillus cereus

Zusammenfassung Bei dem untersuchten Transportsystem für Thiamin bei Bacillus cereus wechseln rhythmisch 1–2 h andauernde Aufnahme-und Abgabephasen miteinander ab. Diese großen Phasen sind in kleinere von durchschnittlich 45 s Dauer unterteilt. Die Geschwindigkeit der Thiaminaufnahme wird von pH-Wert, Temperatur, Alter der Zellen, Energie-und Nährstoffversorgung sowie Thiaminkonzentration des Mediums beeinflußt. Sie folgt der Michaelis-Menten-Kinetik: K _m =1,98x10^-8 M; V _max=1,19x10^-6 mol/g TGxmin. Gefördert wird die Aufnahmerate durch K⁺, Ca²⁺ und Mg²⁺, gehemmt wird sie durch Pyrithiamin, EDTA, H⁺-Ionen, Wasserstoffacceptoren und-donatoren; OH^--Ionen bewirken eine Umkehr der Transportrichtung. Als erklärende Theorie wird eine Kopplung der Thiaminpermeation mit Protonenverschiebungen in der Membran diskutiert.

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Studies on the thiamine transport system in Bacillus cereus

The thiamine transport system in Bacillus cereus exhibits rhythmical changes of resorption-and excretion-phases lasting 1–2 h. These main phases are subdivided in shorter ones with an average duration of 45 s. The velocity of the thiamine uptake is influenced by pH, temperature, age of cells, energy and substrate supply and thiamine concentration of the medium. The Michaelis-Menten-Kinetic can be used to describe the uptake: K _m =1.98x10^-8 M; V _max=1.19x10^-6 mol/g dry weightxmin. The rate is enhanced by K⁺, Ca²⁺ and Mg²⁺, and inhibited by Pyrithiamin, EDTA, H⁺-ions, proton donors and proton acceptors; OH^--ions cause a change in the direction of transport. A theoretical explanation can be given by assuming a coupling of the thiamine permeation with proton movements in the membrane.

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Liste der Abkürzungen AMP Adenosinmonophosphat - ADP Adenosindiphosphat - ATP Adenosintriphosphat - DNP Dinitrophenol - EDTA Athylendiamintetraessigsäure - FAD Flavinadenindinucleotid - NAD Nicotinamidadenindinucleotid - NADP Nicotinamidadenindinucleotidphosphat - TPP Thiaminpyrophosphat     

Purification and Properties of NADH-Dependent 5,10-Methylenetetrahydrofolate Reductase (MetF) from Escherichia coli

A K-12 strain of Escherichia coli that overproduces methylenetetrahydrofolate reductase (MetF) has been constructed, and the enzyme has been purified to apparent homogeneity. A plasmid specifying MetF with six histidine residues added to the C terminus has been used to purify histidine-tagged MetF to homogeneity in a single step by affinity chromatography on nickel-agarose, yielding a preparation with specific activity comparable to that of the unmodified enzyme. The native protein comprises four identical 33-kDa subunits, each of which contains a molecule of noncovalently bound flavin adenine dinucleotide (FAD). No additional cofactors or metals have been detected. The purified enzyme catalyzes the reduction of methylenetetrahydrofolate to methyltetrahydrofolate, using NADH as the reductant. Kinetic parameters have been determined at 15°C and pH 7.2 in a stopped-flow spectrophotometer; the K_m for NADH is 13 μM, the K_m for CH₂-H₄folate is 0.8 μM, and the turnover number under V_max conditions estimated for the reaction is 1,800 mol of NADH oxidized min⁻¹ (mol of enzyme-bound FAD)⁻¹. NADPH also serves as a reductant, but exhibits a much higher K_m. MetF also catalyzes the oxidation of methyltetrahydrofolate to methylenetetrahydrofolate in the presence of menadione, which serves as an electron acceptor. The properties of MetF from E. coli differ from those of the ferredoxin-dependent methylenetetrahydrofolate reductase isolated from the homoacetogen Clostridium formicoaceticum and more closely resemble those of the NADH-dependent enzyme from Peptostreptococcus productus and the NADPH-dependent enzymes from eukaryotes.     

Properties and physiological function of a glutathione reductase purified from spinach leaves by affinity chromatography

Glutathione reductase (EC 1.6.4.2) was purified from spinach (Spinacia oleracea L.) leaves by affinity chromatography on ADP-Sepharose. The purified enzyme has a specific activity of 246 enzyme units/mg protein and is homogeneous by the criterion of polyacrylamide gel electrophoresis on native and SDS-gels. The enzyme has a molecular weight of 145,000 and consists of two subunits of similar size. The pH optimum of spinach glutathione reductase is 8.5–9.0, which is related to the function it performs in the chloroplast stroma. It is specific for oxidised glutathione (GSSG) but shows a low activity with NADH as electron donor. The pH optimum for NADH-dependent GSSG reduction is lower than that for NADPH-dependent reduction. The enzyme has a low affinity for reduced glutathione (GSH) and for NADP⁺, but GSH-dependent NADP⁺ reduction is stimulated by addition of dithiothreitol. Spinach glutathione reductase is inhibited on incubation with reagents that react with thiol groups, or with heavymetal ions such as Zn²⁺. GSSG protects the enzyme against inhibition but NADPH does not. Pre-incubation of the enzyme with NADPH decreases its activity, so kinetic studies were performed in which the reaction was initiated by adding NADPH or enzyme. The Km for GSSG was approximately 200 M and that for NADPH was about 3 M. NADP⁺ inhibited the enzyme, assayed in the direction of GSSG reduction, competitively with respect to NADPH and non-competitively with respect to GSSG. In contrast, GSH inhibited non-competitively with respect to both NADPH and GSSG. Illuminated chloroplasts, or chloroplasts kept in the dark, contain equal activities of glutathione reductase. The kinetic properties of the enzyme (listed above) suggest that GSH/GSSG ratios in chloroplasts will be very high under both light and dark conditions. This prediction was confirmed experimentally. GSH or GSSG play no part in the light-induced activation of chloroplast fructose diphosphatase or NADP⁺-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. We suggest that GSH helps to stabilise chloroplast enzymes and may also play a role in removing H₂O₂. Glucose-6-phosphate dehydrogenase activity may be required in chloroplasts in the dark in order to provide NADPH for glutathione reductase.Abbreviations GSH reduced form of the tripeptide glutathione - GSSG oxidised form of glutathione     

Untersuchungen über die Strahlenresistenz einiger psychrophiler Bakterien und Hefen vom Seefisch

Zusammenfassung Bei einer größeren Anzahl, aus der Mikroflora vom Seefisch isolierter, psychrophiler Bakterien- und Hefestämme wurde die Strahlenresistenz gegenüber Bestrahlung mit 60 kV Röntgenstrahlen bestimmt. Von den untersuchten Stämmen waren die Micrococcus- und Hefe-Stämme mit D-Werten (=LD₉₀) von 23–74 kr am strahlenresistentesten, die Pseudomonas-und Flavobacterium-Stämme mit D-Werten von 2,8–6,0 kr am strahlenempfindlichsten. Eine mittlere Strahlenresistenz zeigten die Achromobacter-, Corynebacterium- und Aeromonas-Stämme mit D-Werten von 8–19 kr.Die Strahlenempfindlichkeit der psychrophilen Bakterien wurde weder durch das Alter der Kulturen noch durch die Bebrütungstemperatur nach der Bestrahlung beeinflußt.Mitteilung aus der Bundesforschungsanstalt für Lebensmittelfrischhaltung, KarlsruheZentralforschungsinstitut für Lebensmittelinsustrie, Herman Ottó-út 15, Budapest, II. (Ungarn), als Stipendiat der International Atomic Energy Agency, Wien (Österreich).     

Studies of nitrate reductase in the fresh water dinoflagellatePeridinium cinctum

Nitrate reduction was studied in the dinoflagellatePeridinium cinctum collected from extensive algal blooms in Lake Kinneret (Israel).Among several methods tested for the preparation of cell free extracts, only the use of a ground-glass tissue culture homogenizer was found to be efficient. The assimilatory nitrate reductase ofP. cinctum was located in a particulate fraction. In this respect,P. cinctum did not behave like other eukaryotes, such as green algae, but as a prokaryote. Nitrite reductase activity was found in the soluble fraction.Nitrate reductase used NADH as a preferable electron donor; it reacted also with NADPH but only to give 16.5% of the NADH dependent rate. Methyl viologen and benzyl viologen could also serve as electron donors, with rates higher than the NADH dependent activity (3–6 times and 1.5–3 times, respectively). The Km of nitrate reductase for NADH was 2.8×10^–4 M and for NO₃-1.9×10^–4 M. Flavins did not stimulate the activity, nor was ferricyanide able to activate it. Carboxylic anions stimulated nitrate reductase activity 3–4 fold, an effect which was not mimicked by other anions.Chlorate, azide and cyanide were competitive inhibitors ofP. cinctum, nitrate reductase withK _i values of 1.79×10^–3 M, 2.1×10^–5 M and 8.9×10^–6 M respectively.     

Purification and characterization of ferredoxin-NADP<Superscript>+</Superscript> reductase encoded by <Emphasis Type="Italic">Bacillus subtilis yumC</Emphasis>

From Bacillus subtilis cell extracts, ferredoxin-NADP⁺ reductase (FNR) was purified to homogeneity and found to be the yumC gene product by N-terminal amino acid sequencing. YumC is a 94-kDa homodimeric protein with one molecule of non-covalently bound FAD per subunit. In a diaphorase assay with 2,6-dichlorophenol-indophenol as electron acceptor, the affinity for NADPH was much higher than that for NADH, with K_m values of 0.57 M vs >200 M. K_cat values of YumC with NADPH were 22.7 s^–1 and 35.4 s^–1 in diaphorase and in a ferredoxin-dependent NADPH-cytochrome c reduction assay, respectively. The cell extracts contained another diaphorase-active enzyme, the yfkO gene product, but its affinity for ferredoxin was very low. The deduced YumC amino acid sequence has high identity to that of the recently identified Chlorobium tepidum FNR. A genomic database search indicated that there are more than 20 genes encoding proteins that share a high level of amino acid sequence identity with YumC and which have been annotated variously as NADH oxidase, thioredoxin reductase, thioredoxin reductase-like protein, etc. These genes are found notably in gram-positive bacteria, except Clostridia, and less frequently in archaea and proteobacteria. We propose that YumC and C. tepidum FNR constitute a new group of FNR that should be added to the already established plant-type, bacteria-type, and mitochondria-type FNR groups.