杆状病毒早期基因启动子载体的构建及报道基因的表达

以ＡｃＮＰＶｐ１０基因为侧翼序列,用ＡｃＮＰＶ的ＩＥ１基因启动子构建了杆状病毒早期基因启动子载体,并将新霉素抗性基因（ｎｅｏ）插入ＩＥ１基因启动子下游,得到转移载体ｐＡｃＰＩｎｅｏ。将它和野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,由于ｎｅｏ基因的表达,通过Ｇ４１８的选择和富集作用,得到重组病毒ｖＡｃＰＩｎｅｏ的纯培养。用酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证明,ｎｅｏ基因整合于ＡｃＮＰＶ基因组的ｐ１０基因位相。用重组病毒感染昆虫细胞,不同时间取样提取ＲＮＡ并进行杂交,结果表明ｎｅｏ基因在受染细胞内从早期到晚期都可发生转录。     

昆虫杆状病毒晚期启动子在大肠杆菌中启禖AT基因表达

将油桐尺蠖核多角体病毒晚期基因－多角体蛋白基因启动子及５’端编码区,以两种不同方式置于缺乏启动子的氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）基因上激,使其分别终止在不同翻译终止位点,其宿主菌具有明显不同的氯霉素抗性,最高达２００ｍｇ／ＬＬＢ培养基以上,表明昆虫病毒启动子能启动原核基因表达,对多角体蛋白基因启动子能在大肠杆菌中有效工作的原因进行了讨论。     

昆虫杆状病毒泛青基因研究进展

昆虫杆状病毒是目前已知唯一编码泛素（ubiquitin）的病毒。迄今,已克隆了8种该类病毒的泛素基因。与真核生物Uba52(80)相似,这些基因在一个泛素分子的C－末端都有不同长度的融合,其中余纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）的ubiquitin-gp37基因是一个典型的融合基因。近年来,对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa california multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）泛素的定位与功能研究取得了重要进展。     

GUS基因—植物基因工程中重要的报道基因

研究高等植物基因表达,特别是调控机理,常常需将基因或调控片段从原来的背景下分离出来,采用与报道基因融合的方法,通过基因的体外转移进行精确的分析。至今为止,在高等植物基因表达的研究中,至少用过6种报道基因:A、β一半乳糖苷酶(β-galatosidase)基因;B、氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicolacetyl-transferase,CAT)基因;C、新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,NPTⅡ)基因;D、胭脂碱合成酶(nopaline synthase)基因;E、章鱼碱合成酶(octopine synthase)基因;F、荧光素酶     

杆状病毒载体及其在昆虫细胞中表达外源基因的研究进展

本文介绍了杆状病毒载体在昆虫细胞中表达外源基因的基本策略和发展趋势。杆状病毒载体系统近年来已被人们广泛用来表达人类、动物和植物等的一些重要蛋白质分子,在医学、农业等领域的基因工程研究中发挥了越来越大的作用。杆状病毒载体系统表达外源基因的效率高,表达产物的结构和活性与天然产物一致,为当今基因工程研究中最有发展前途的病毒载体表达系统。     

昆虫杆状病毒若干基因的研究进展

昆虫杆状病毒 (Ｉｎｓｅｃｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ)对鳞翅目、双翅目和膜翅目等昆虫具有病原性 ,是一种开发应用较广、高效的生物杀虫剂 ,具有杀虫专一、效果好、有流行传播作用等优点。为了更好地利用昆虫杆状病毒为防治农林害虫服务 ,加快昆虫杆状病毒杀虫剂研究的步伐 ,本     

昆虫杆状病毒若干基因的研究进展

昆虫杆状病毒(Insect baculovirus)对鳞翅目、双翅目和膜翅目等昆虫具有病原性,是一 种开发应用较广、高效的生物杀虫剂,具有杀虫专一、效果好、有流行传播作用等优点.为 了更好地利用昆虫杆状病毒为防治农林害虫服务,加快昆虫杆状病毒杀虫剂研究的步伐,本文归纳了近几年来有关昆虫杆状病毒基因研究进展供从事研究的人员参考.     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在杆状病毒载体与昆虫细胞体系中的表达

根据杆状病毒A组代表种苜蓿Y纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica Nuclear Po-lyhedrosis Virus,简称AcNPV)的分子生物学资料,我们采用分子剪裁和拼接手段,对AcNPV多角体蛋白基因加以修饰,并用人工合成定位探针,获得大约在该基因的ATG转译起始密码子一9处加有合成BamHl连接序列的转移载体质粒pAc—MV。 再与从乙肝病毒adw亚型的表面抗原基因HBng亚克隆株pYPss一1分出带有Ban·Hl粘性末端的HBsAg基因,构建表达载体质粒pAc—MV—HBsAgo经与野生型AcNPV DNA对Spodoptem 7rugJPerda细胞共转染,借助同源交换,获得插有HBsAg基因的多角体缺陷的重组病毒。根据HBsAg诊断血球凝集试验和HBs^g诊断酶标免疫测定,表明重组病毒使HBsAg基因在昆虫细胞中得到了表达,免疫电镜显示表达产物呈球状颗粒,大小约为22nm。表达产物粗制品按1μg／鼠对bal b／c鼠免疫,并于三周后强化免疫能产生抗体。由HBsAg纯样品酶标免疫法标定的标准曲线估计每升培养物的表达产物约{一8mg,细胞量为1一2×106个/ml.用重组病毒感染玉米螟4龄幼虫,也获得HBsAg基因的表达,展示了简易生产HB sag诊断试剂和疫苗的可喜前景。     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素（ｐＧＨ）基因的ｃＤＮＡ进行测序,得到ｐＧＨｃＤＮＡ的全序列,并与Ｓｅｅｂｕｒｇ等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白ＸＩＶ启动子的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４构建出含ｐＧＨ基因的重组质粒ｐＸ３／４－ｐＧＨ。将ｐＸ３／４－ｐＧＨ与致死缺失型线性化ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,构建出既能形成多角体又能表达ｐＧＨ基因的苜蓿丫纹夜蛾     

外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。     

昆虫杆状病毒泛素基因研究进展

昆虫杆状病毒是目前已知唯一编码泛素(ubiquitin)的病毒。迄今,已克隆了8种该类病毒的泛素基因。与真核生物Uba52(80)相似,这些基因在一个泛素分子的C末端都有不同长度的融合,其中斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)的ubiquitingp37基因是一个典型的融合基因。近年来,对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacaliforniamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)泛素的定位与功能研究取得了重要进展 。     

杆状病毒囊膜糖蛋白gp64基因启动子活性分析

GP64是杆状病毒在其发育循环第一时相所产生的芽生型病毒粒子（budded voirus,BV)的特异性囊膜糖蛋白。它在病毒入侵细胞过程中具有重要作用。为了探明杆状病毒gp64基因的表达调控。从所克隆的BmNPV和AcMNPVgp64基因ATG上游437-439bp启动子的序列分析发现。该启动子同时具有早期和晚期转录模体,将所构建的该启动子控制下荧光素酶报告基因（Luc)的非融合表达质粒分别转染Bm-N和Sf-21细胞进行瞬间表达分析,BmNPVgp64启动子能被允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,AcMNPVgp64启动子既能被允许宿主Sf-21又能被非允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,同时,这两个启动子的转录活性在各自的允许宿主细胞中被相应的病毒因子所反式激活2.4-4倍。将家吞核多角体病毒同源重复序列3（BmNPV homologous region-3,hr3)克隆到该启动子控制下的Luc报告基因下游,用所构建的质粒分别转染细胞,瞬间表达分析结果表达,BmNPVhr3能分别增强该启动子在Bm-N和Sf-21细胞中的转录活性13-22倍和7000-14000倍以上,同时,相应的病毒因子能反式激活插入了hr3的gp64启动子在各自允许宿主细胞中转录活性73-78倍,这暗示着BmNPVhr3除了具有病毒DNA复制原点和增强子的功能外,它在病毒的反式激活过程中起着重要的作用。     

利用HSV1 α-基因启动子构建真核表达载体phIE

以pcDNA3质粒为骨架,构建由1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus I,HSVI)立即早期基因启动子指导外源蛋白转录的phIE真核表达载体,该质粒为外源蛋白的表达提供了更为广泛的选择,通过插入us1编码序列,phIE-Us1被用于分析ICP22蛋白在病毒感染早期的功能;在多克隆位点插入氯霉素乙酰转移酶编码基因构建phIE-CAT检测载体,应用于检测HSVI病毒蛋白Vp16及ICP22的功能,明确显示该质粒对于研究单纯疱疹病毒的基因转录调控具有重要的应用价值。     

利用HSV1α-基因启动子构建真核表达载体phIE

以pcDNA3质粒为骨架,构建由1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus I,HSVI)立即早期基因启动子指导外源蛋白转录的phIE真核表达载体,该质粒为外源蛋白的表达提供了更为广泛的选择,通过插入us1编码序列,phIE-Us1被用于分析ICP22蛋白在病毒感染早期的功能;在多克隆位点插入氯霉素乙酰转移酶编码基因构建phIE-CAT检测载体,应用于检测HSVI病毒蛋白Vp16及ICP22的功能,明确显示该质粒对于研究单纯疱疹病毒的基因转录调控具有重要的应用价值.     

不同启动子在昆虫杆状病毒表达系统中的活性分析

为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性, 利用对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)的ie1启动子及其截短的mie1启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子PPH, 构建了含有不同启动子控制下的EGFP报告基因的重组杆状病毒, 分别感染Sf9昆虫细胞, 利用流式细胞术检测报告基因的表达水平。结果表明, WSSV的ie1启动子和杆状病毒的mETL启动子在昆虫细胞Sf9细胞中都具有较强而早的启动子活性, 能够控制报告基因早期高效表达, 而PPH在感染后期才表现较强活性。并且研究中发现, 杆状病毒同源重复区(hr1)可以增强ETL启动子的活性。