杆状病毒早期基因启动子载体的构建及报道基因的表达

以ＡｃＮＰＶｐ１０基因为侧翼序列,用ＡｃＮＰＶ的ＩＥ１基因启动子构建了杆状病毒早期基因启动子载体,并将新霉素抗性基因（ｎｅｏ）插入ＩＥ１基因启动子下游,得到转移载体ｐＡｃＰＩｎｅｏ。将它和野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,由于ｎｅｏ基因的表达,通过Ｇ４１８的选择和富集作用,得到重组病毒ｖＡｃＰＩｎｅｏ的纯培养。用酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交证明,ｎｅｏ基因整合于ＡｃＮＰＶ基因组的ｐ１０基因位相。用重组病毒感染昆虫细胞,不同时间取样提取ＲＮＡ并进行杂交,结果表明ｎｅｏ基因在受染细胞内从早期到晚期都可发生转录。     

棉铃虫核型多角体病毒凋亡抑制基因对p35基因失活病毒的功能拯救

野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）能感染棉铃虫细胞,不引起细胞凋亡,用ＬａｃＺ基因使ＡｃＮＰＶ凋亡抑制基因ｐ３５插入失活,得到缺陷病毒Ａｃｐ３５Ｚ能迅速引起棉铃虫细胞凋亡,但缺陷病毒本身不能复制。用ＡｃＮＰＶ即早期基因ＩＥ１启动子带动棉铃虫杆状病毒（ＨａＮＰＶ）ｐ３５基因在棉铃虫细胞中瞬时表达,能拯救ｐ３５基因失活病毒Ａｃｐ３５Ｚ复制。通过Ｘ－ｇａｌ显色反应和ｄｏｔＥＬＩＳＡ分别检测到了半乳糖苷酶的活性和ｐ３５基因的表达,证明了所克隆的ＨａＮＰＶｐ３５基因不仅是一个凋亡抑制基因,也是一个与杆状病毒复制相关的基因,它的瞬时表达能支持Ａｃｐ３５Ｚ在棉铃虫细胞中复制。     

汉滩病毒核壳蛋白（NP）在杆状病毒系统的表达及其免疫原性研究

应用杆状病毒表达载体成功地表达了汉滩病毒７６－１１８株（ＨＴＮＶ）核壳蛋白,将ＨＴＮＶＳ基因插入杆状病毒转染质粒ｐＡｃＹＭＩＢ的多角体基因启动子下游附近,与经Ｂｓｕ３６１酶切线性化的杆状病毒（ＡｃＶＥＰＡ）ＤＮＡ共同转染Ｓ１９细胞,经空斑筛选获得了高效表达ＮＰ的重组杆状病毒（ＡｃＶＨａｎＳ）。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实,表达产物与ＨＴＮＶ毒粒ＮＰ分子量均为５０ＫＤ左右,紫外扫     

粘虫核型多角体病毒凋亡抑制基因的定位,序列和启动子结构

以ＡｃＮＰＶ凋亡抑制基因ｐ３５为探针,与ＬｓＮＰＶＤＮＡ的限制性片段和ＬｓＮＰＶＤＮＡＥｃｏＲＶ片段杂交,发现ＥｃｏＲＶ５．５ｋｂ片段有强烈的杂交信号。将此片段亚克隆后,测定了１２４４ｂｐ序列,发现一个完整的ＯＲＦ,推导的３０２个氨基酸与ＡｃＮＰＶｐ３５蛋白有７０．４％的氨基酸同源性,证明所测ＯＲＦ为ＬｓＮＰＶ的ｐ３５基因。结构分析发现其５′端有早期基因启动子元件ＧＣ、ＡＣＧＴ和ＴＡＴＡｂｏｘ。有２２ｂｐ的顺向重复序列,包括由两个重叠的ＴＡＴＡｂｏｘ和上下游两个ＡＣＧＴｍｏｔｉｆ组成的两套启动子元件,这些结构特征与ＡｃＮＰＶ的凋亡抑制基因十分相似。     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素（ｐＧＨ）基因的ｃＤＮＡ进行测序,得到ｐＧＨｃＤＮＡ的全序列,并与Ｓｅｅｂｕｒｇ等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白ＸＩＶ启动子的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４构建出含ｐＧＨ基因的重组质粒ｐＸ３／４－ｐＧＨ。将ｐＸ３／４－ｐＧＨ与致死缺失型线性化ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,构建出既能形成多角体又能表达ｐＧＨ基因的苜蓿丫纹夜蛾     

斜纹夜蛾核型多角体病毒p74基因的克隆和序列分析

用ＡｃＮＰＶｐ７４基因３’端的１．４ｋｂ片段,通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ将ＳｐｌｔＮＰＶ的ｐ７４基因定位于ＸｈｏＩ（４．９ｋｂ）、ＥｃｏＲＩ（４．４ｋｂ）、ＢａｍＨＩ（３．０ｋｂ）片段上。进一步用ＥｘｏⅢ和构建亚克隆测序法,对长２５４５ｂｐ的ｐ７４基因进行,其中１９７４ｂｐ的编码编码６５８个氨基酸,蛋白分子量约７５．８７ｋＤ,其编码蛋白与ＡｃＭＮＰＶ和ＣｆＭＮＰＶｐ７４蛋白的氨基酸序列同     

Epstein—Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白     

Epstein-Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白联合免疫效果相似。不同启动子控制下的ＭＡ基因,诱发小鼠免疫应答无明显差异。     

HcNPV半胱氨酸蛋白酶,几丁质酶基因失活分析

将含有美国白蛾核型多角体病毒（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｍｅａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ,ＨｃＮＰＶ）半胱氨酸蛋白酶基因（ＣＰ）的自然和几丁质酶基因（ＣｈｉＡ）的片段克隆进ＰＣＲⅡ,构建了转移载体ｐＨｃＣＶｄｅｌ;将含有ＨｃＮＰＶ多角体蛋白全基因（ｐｏｌｈ）序列的片段插入到ｐＨｃＣＶｄｅｌ的ＥｃｏＲＩ位点,得到重组转移载体ｐＨｃＣＶｐｏｌｈ。通过重组转移载体与含有家蚕促     

荧光素酶基因的克隆表达及其产物纯化和鉴定

利用能形成多角体的杆状病毒载体系统ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３,把萤火虫荧光素酶（Ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ,Ｌｕｃ）ｃＤＮＡ克隆到转移功体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋３／３通过共转染草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ,Ｓｆ）细胞得到重组毒株ＴｎＮＰＶ－Ｌｕｃ－ＯＣＣ,在该重组杆状病毒株中Ｌｕｃ基因受到合成启动子和ＸＩＶ启动子的双重调控。该重组杆状病毒株在Ｓｆ９细胞中能形成多角体,有Ｘ－     

人乳头瘤病毒16型E6基因的T—A克隆及在真核细胞中的表达

由于ＨＰＶ１６Ｅ６蛋白能诱导机体保护性免疫反应,可作为基因治疗的靶抗原。用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了ＨＰＶ１６Ｅ６基因工程蛋白,拟用于宫颈癌细胞系小鼠模型抗癌的免疫治疗。用ＰＣＲ技术从ＨＰＶ１６基因组中扩增获得转化基因Ｅ６的完整ＯＲＦ,按ＴＡ策略将其克隆到自行制备的杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３Ｔ尾载体中,置于杆状病毒ＡｃＭＮＰＶＰｏｌｈ晚期启动子控制之下,用此重组转移质粒ｐＶＬ１３９３Ｅ６与杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６蛋白基因的重组杆状病毒株,并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达为非融合性Ｅ６蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析其分子量约为１８ｋＤ,免疫印迹实验表明,此重组蛋白能被兔抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体所识别。     

人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达

人尿激酶原是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性,为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达ｐｒｏ－ＵＫ,我们在ｐＡｃ３７３基础上,插入野生型ＡｃＭＮＰＶ ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ启动子区－７～－１碱基序列,构建了一个高表达转移载体ｐＡｃＹＴ．分别经三次克隆将ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ正向插入到转移载体ｐＡｃ３７３或ｐＡｃＹＴ的ＢａｍＨＩ－ＫｐｎＩ位点上。用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将ｐＡｃＹＴ－ＵＫＤＮ     

人I型免疫缺陷病毒gag—env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Ｇａｇ和Ｅｎｖ蛋白是人Ｉ型免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １,ＨＩＶ－１）的结构蛋白,是ＨＩＶ－１诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多交亚克隆,将ｅｎｖ基因以正确的三联密码读框插入ｇａｇ基因的下游制备了ＨＩＶ－１ ｇａｇ－ｅｎｖ嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒ｐ７．５启动子和牛痘病毒Ａ型包涵体（ＡＴＩ）启动子的下游,经过同源     

BIV—1—gp120在重组杆状病毒系统中的表达

将中国株ＨＩＶ－１Ｂ亚型ｇｐ１２０全基因序列克隆到杆状病毒转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＩ中多角体启动子下游,构建成重组转座载体ｐＦａｓｔＢａｃＩ－ｇｐ１２０,利用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞Ｓｆ９中高效表达了ＨＩＶ－１的外膜糖蛋白ｇｐ１２０,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析结果一致,证明表达了２种糖基化程度不同的ｇｐ１２０。     

茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白基因核苷酸序列及其在Baculoviridae中的地位(英文)

茶尺蠖核型多角体病毒（ＥｏＳＮＰＶ）基因组的ｐｏｌｈ和ｅｇｔ基因区约１４．２ｋｂ的酶切图谱被构建．ｅｇｔ基因位于ｐｏｌｈ基因上游约４．８ｋｂ处,但转录方向与ｐｏｌｈ基因相反．ＥｃｏＲⅤ－Ｌ片段ｐｏｌｈ基因及其旁侧的１１２５核苷酸序列被测定．ｐｏｌｈ基因编码区长７３８核苷酸,可编码２４６氨基酸的多肽．起始密码子ＡＴＧ上游是一个富含ＡＴ（ＡＴ占７１．２％）的启动子区,在－５２核苷酸处有杆状病毒晚期基因启动子转录起始基序ＡＴＡＡＧ．在终止密码子下游２０８核苷酸有一个ｐｏｌｙ（Ａ）信号,ＡＡＴＡＡＡ．但ＥｏＳＮＰＶｐｏｌｈ基因起始密码子ＡＴＧ相邻核苷酸序列为ＧＴＡＡＴＧＴ,其－３是个Ｇ,这与已知的１６种其它杆状病毒ｐｏｌｈ基因－３位置均是Ａ不相同．在分析了ＥｏＳＮＰＶ和ＨａＳＮＰＶ多角体蛋白基因核苷酸序列的基础上,通过ＭＡＬＩＧＮ程序,比较了目前已发表的２６种杆状病毒包涵体蛋白的序列,ＥｏＳＮＰＶ与黄杉毒蛾核型多角体病毒（ＯｐＳＮＰＶ）的同源性为最高,核苷酸序列的同源性为８３．０％,氨基酸序列达９４．７％;与其它２０种鳞翅目ＮＰＶ的同源性也很高,核苷酸序列同源性为７２．６％～８１．９％,氨基酸序列为８３．７％～９３     

牛免疫缺陷病毒长末端重复序列（BIV—LTR）在大肠杆菌中的启动子功能

牛免疫缺陷病毒的长末端重复序列含有病毒的启动子,调控病毒在真核细胞中的表达。我们将ＢＩＶ ＬＴＲ与萤火虫荧光素酶基因连接构建成重组质粒ｐＢＩＶ＝Ｌｕｃ,该质粒能在Ｅ．ｃｏｌｉ中有效地表达出荧光素酶的活性,从而证明了ＢＩＶ ＬＴＲ在大肠杆菌中也具有启动子功能。     

家蚕核型多角体病毒egt基因的结构和功能分析

以苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）的ｅｇｔ基因作探针,从家蚕核型多角体病毒镇江株（ＢｍＮＰＶ ＺＪ－８）基因组中克隆了ｅｇｔ基因及其旁侧序列,作了该片段的酶切图谱;测定了ＢｍＮＰＶ ＺＪ－８ｅｇｔ基因序列。与ＡｃＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因相比同源性为９５％;基因大小都为１５１８ｂｐ。利用ｅｇｔ基因旁侧序列构建了转移载体ｐＵＤｅｇｔ,以绿色荧色光蛋白基因（ＥＧＦＰ）作报告基因取代ｅｇｔ基因,构建     

粘虫核型多角体病毒一个新基因的序列和结构研究

本文报道ＴｓＮＰＶＤＮＡＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ的５．５ｋｂ片段的克隆及其物理图谱。测定了其中一个８１９ｂＰ片段的全序列。在长３４６ｂｐ的完整ＯＲＦ的５’端除有ＴＡＴＡｂｏｘ和ＣＡＡＴｂｏｘ以外,还发现有典型的早期基因启动子元件ＡＣＧＴ和ＧＣ单元以及晚期基因的转录起始保守序列ＴＴＡＡＧ。预测的ＯＲＦ产物为１１４个氨基酸、分子量为１３ｋＤ的蛋白质,故命名为ｐ１３蛋白。在ｐ１３基因的Ｃ端和Ｎ端分别有一个亮氨酸拉链和两个类亮氨酸拉链结构（我们称为亮氨酸转型结构和ＬＶＴ重复结构〕．从终止密码起有一个双发卡环结构,ｐ１３基因的５’端调控单元及其排列与ＢｍＮＰＶ和ＡｃＮＰＶ的细胞序死抑制基因（ｐ３５）十分相似,但ｐ１３基因与已经发现的杆状病毒基因序列和氨基酸序列没有同源性．因此,这是一个新的早晚期基因,其调控元件可能具有重要功能。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的亚克隆及构建转基因鱼的表达载体

用限制性内切酶Ｐｓｔ Ｉ部分消解含有美洲鲽抗冻蛋白基因的ｐＣＴ５质粒,分离得到３２４ｂｐ的片段,将此片段亚克隆到ｐＵＣ１９质粒中,筛选到ｐＵＣ－ＡＦ重组子。从ｐＵＣ－ＡＦ重组子中,用ＢａｍＨＩ和ＨｉｒｄⅢ切下３２４ｂｐ的抗冻蛋白基因,再重组到含有ＳＶ４０病毒启动子的ｐＫＳＶ－１０的载体中,构建成转基因鱼的表达载体,此表达载何可用于鱼的基因转移的研究。     

IL—2重组杆状病毒载体的构建及表达

将人白细胞介素２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ插入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮ－ＰＶ）的转移载体ｐＶＬ１３９２中。经限制性酶切和ＤＮＡ杂交筛选、鉴定出重组转移载体ｐＶＬ１３９２－ＩＬ２。重组载体通过在昆虫细胞内共转染将ＩＬ－２ｃＤＮＡ转移到野生型ＡｃＮＰＶＤＮＡ中。经３２Ｐ标记探针鉴定出重组病毒Ａｃ１３９２－ＩＬ２。用重组病毒感染昆虫细胞,结果表达产物有明显刺激ＣＴＬＬ细胞生长,［３Ｈ］－ＴｄＲ掺入法检测ＩＬ－２活性为１５００ＩＵ／ｍ１。