核酸免疫可特异地诱发小鼠对乙型肝炎病毒表面抗原S+PreS1免疫反应

运用改造后的乙型肝炎病毒表面抗原Ｓ＋ＰｒｅＳ１融合基因（将ＰｒｅＳ１区肝细胞受体结合位点（２１－４７ａａ）编码基因融合到Ｓ蛋白Ｃ端２２３位残基下游）,构建了一系列真核表达载体,并在ＣＨＯ细胞上有效表达了分泌型的、具有Ｓ＋ＰｒｅＳ１双重抗原性的融合蛋白颗粒。用上述质粒ＤＮＡ肌肉免疫Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠,成功地检测到了抗－ＨＢｓ和抗－ＰｒｅＳ１抗体,加强免疫能显著改善免疫效果。本研究还建立了检测抗－ＰｒｅＳ１的竞争抑制法和羊抗人ＨＢｓＡｇ封闭法,两种方法符合率达９６％,但后者更为敏感。用羊抗人ＨＢｓＡｇ封闭法测得抗－ＰｒｅＳ１滴度最高可达１：１２８０以上。     

乙型肝炎病毒前S2抗原决定簇（HBVPreS2epitope）与乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶＰｒｅＳ２）肽段由５５个氨基酸组成,其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇。我们将化学合成的ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因与ＨＢｃＡｇ基因不同位点进行融合,融合基因在大肠杆菌中获得表达,并对融合蛋白进行了纯化。经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ实验表明,融合蛋白具有ＰｒｅＳ２和ＨＢｃＡｇ两者的抗原性。此外,研究还表明,强启动子能使表达水平有一定提高。     

大肠杆菌脂蛋白在CTB—pres2抗原基因的融合及表达

首次采用基因融合方式,在乱毒素Ｂ亚基－乙型肝炎病毒Ｐｒｅｓ２抗原融合基因的５‘端引入编码大肠杆菌脂蛋白信号肽及Ｎ端九个氨基酸的核苷酸序列,分别置于ｃｔｂ及ｌａｃ启动子下在大肠杆菌中获得分泌性表达,表达的融合蛋白均定位于膜上,并且可以和ＧＭ１、抗－ＣＴＢ抗体及ＨＢＶＰｒｅＳ２单克隆抗体结合说明该融合蛋白保留了ＣＴＢ的基本高级结构及ＣＴＢ、ＰｒｅＳ２抗原的抗原性,＾３Ｈ－棕榈酸标记实验证实该融合蛋白发     

乙肝前S2抗原决定簇串联体与核心抗原的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶＰｒｅＳ２）肽段由５５个氨基酸组成,其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇,为增强ＰｒｅＳ２的抗原性,本实验采用将化学合成的ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因以串联方式与ＨＢｃＡｇ的基因进行了融合,融合基因在大肠杆菌中获得表达,并通过ＥＬＩＳＡ比较研究了融合蛋白中ＰｒｅＳ_２ｅｐｉｔｏｐｅ单体及串联体的抗原性差异。     

乙型肝炎病毒前S2抗原决定簇与乙型肝炎病毒核心抗原的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶ ＰｒｅＳ２）肽段由５５个氨基酸组成,其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇。我们将化学合成的ＰｒｅＳ２ ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因不同位点进行融合,融合基因在大肠杆菌中获得表达,并对融合蛋白进行了纯化。经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ实验表明,融合蛋白具有ＰｒｅＳ２和ＨＢｃＡｇ两者的抗原性。此外,研究还表明,强启动子能使表达水平有一定的提高。     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．     

乙型肝炎病毒表面抗原S和前S1融合基因转基因细胞系的建立与细胞性质的研究

构建了ｐＣＨＢＳＳＩＧ质料,其特点是ＣＭＶ立即早期启动子调控乙型肝炎（乙肝）表面抗原Ｓ＋前Ｓ１融合基因在前,ＳＶ４０早期启动子调控ＧＳ扩增基因在后,此质粒转化到ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中,经克隆加ＭＳＸ及ＭＴＸ筛选、扩增,建立了７个高效表达乙肝表达抗原Ｓ及前Ｓ１融合蛋白细胞系ＧｄＳＳ１,并检测了其中ＧｄＳＳ１－１８细胞系的生物学特性,结果表明：未发现微生物污染,无致瘤性、遗传稳定,电镜下可观察到２     

乙肝前S2抗原决定簇串联体与核心抗原的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶＰｅｒＳ２）肽段由５５个氨基酸组成,其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇,为增强ＰｒｅＳ２的抗原性,本实验采用将化学合成的ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因以串联方式与ＨＢｃＡｇ的基因进行了融合,融合基因在大肠杆菌中获得表达,并通过ＥＬＩＳＡ比较研究了融合蛋白中ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ单体及串联体的抗原性差异。     

丙型肝炎病毒核酸疫苗的免疫效果观察

将丙型肝炎病毒Ｃ＋Ｅ１区基因克隆到不同的真核细胞表达载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）和ｐＳＶＬ中,通过肌肉注射和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ及Ｆ１小鼠后,产生了抗ＨＣＶ／Ｃ区抗体。其中核酸疫苗ｐｃＤＮＡ３．１－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１的免疫高峰的出现早于ｐＳＶＬ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１,Ｆ１小鼠的抗体应答强于ＢＡＬＢ／小鼠。肌肉注射优于皮下注射。     

乙肝PreS_2抗原决定簇和霍乱毒素B亚基基因的融合与表达

通过全化学法按大肠杆菌密码偏性合成了乙肝炎病毒（ＨＢＶ）前Ｓ２抗原（ＰｒｅＳ２）抗原决定簇基因,与霍乱毒素Ｂ亚基基因的３’端融合。重组质粒转化大肠杆菌后融合基因得到高效表达,表达量达３０μｇ／ｍＬ,表达产物９５％以上分泌到胞外。表达的融合蛋白能与神经节苷脂ＧＭ１结合,说明融合蛋白保持了霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）的基本高级结构和生物学功能;酶联免疫吸附实验证明融合蛋白具有ＣＴＢ和ＨＢＶＰｒｅＳ２的抗原性;应用亲和层析纯化后得到了电泳纯融合蛋白制品,为研究融合蛋白免疫原性并进一步构建基因工程肽苗奠定了基础。     

乙肝病毒preS抗原决定簇与核心抗原的融合表达

将乙肝病毒表面抗原的ｐｒｅＳ抗原决定簇片段与核心抗原进行融合,分别构建了在核心抗原中间对应第７５～８３位氨基酸之间的融合及在核心抗原羧端对应第１５６位氨基酸处的融合,并在ｔａｃ启动子的控制下于大肠杆菌中表达。表达产物经ＥＬＩＳＡ检测和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ分析,表明融合蛋白均被表达,其单体分子量大小与推算值一致．电镜观察和ＣｓＣｌ密度梯度超离心测定都表明融合蛋白能形成颗粒,其密度略小于天然的ＨＢｃ颗粒。初步纯化的融合蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠;能产生高滴度的抗－ｐｒｅＳ１抗体,表明ＰｒｅＳｌ（２１～４７）在核心抗原ｅｌｌｏｏｐ区的融合能大大提高其免疫原性．     

抗乙型肝炎病毒表面抗原preS1（20－47）多抗的制备、性质和应用

ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（２１－４７）肽参与乙肝病毒与肝细胞受体的结合。我们用固相法合成了ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（２０－４７）２８肽,并用此肽与ＢＳＡ的偶联物免疫家兔;抗血清经亲和层析纯化后,得到了高纯度、高活力及专一性的抗ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（２０－４７）多抗,它能成功地用于基因工程表达产物及病人血清中的ＰｒｅＳ１抗原的检测。     

乙肝病毒PreSl片段与乙肝表面抗原羧端的融合表达

我们利用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）得到了编码乙肝病毒肝细胞受体结合位点ＰｒｅＳｌ（２１￣４７）的基因片段,并将它分别融合到Ｓ基因中相应于第１７５,１８８和２２３位氨基酸残基处。所得到的融合基因插入痘苗病毒表达载体ｐＧＪＰ－５后,在哺乳动物细胞ＣＶ－１中进行了暂时表达,对融合蛋白的表达、分泌和抗原性的研究表明,３种融合基因均能表达具有Ｓ和ＰｒｅＳｌ双重抗原性的融合蛋白,但融合位点对表达水平和分泌性质有     

人表皮生长因子(EGF)与单核-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合蛋白在大肠杆菌中的表达

应用基因工程技术,将ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ基因克隆到ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）载体的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明ＥＧＦ－ＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白获得表达,并且具有ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ的免疫学活性．这为进一步研究该融合蛋白的功能和肿瘤治疗提供一种新的基因产品．     

丙型肝炎病毒C+E1区基因在原核细胞中的克隆与表达

将丙型肝炎病毒Ｃ＋Ｅ１区基因插入到原核高效表达载体ｐＢＶ２２１质粒中,构建了质粒ｐＢＶ２２１ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１作为表达载体,然后,将含有该质粒的宿主大肠杆菌进行升温诱导表达ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１区基因,并对表达产物进行了生物活性的检测。结果表明,插入到表达载体ｐＢＶ２２１中的ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１基因片段能够得到有效的表达,表达产物主要为非融合蛋白形式存在于细胞中,同时这种Ｃ区和Ｅ１区连接共表达的产物保持了良好的抗原活性     

恶性疟原虫子孢子CS抗原融合基因的表达及其生物活性

采用遗传工程技术了获得了含有恶性疟原虫子孢子ＣＳ抗原融合基因的重组质粒ｐＭＣ０５５－ＣＳ的工程菌株,能高效分泌ＣＳ抗原的融合蛋白至胞外,可达２５ｍｇ／Ｌ,具有霍乱毒素Ｂ亚单位和子孢子ＣＳ的抗原性;将纯化的融合蛋白免疫Ｃ５７纯系小鼠,免疫后抗ＣＴ－Ｂ抗体滴度可达１：３ ２００－６４００,抗ＣＳ抗体滴度可达１：３２０－６４０,免疫小鼠用纸氏疟孢子腹腔攻击,保护率达３４－４５％。     

从中国病人克隆丙型肝炎病毒基因组C区基因及其在大肠杆菌中的表达

本文通过逆转录（ＲＴ）－聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从两份分别来自湖南省娄底地区丙型肝炎病人和河北省秦皇岛市职业献血员丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ打点杂交阳性的血清中,扩增并克隆到１段５６３ｂｐ的ＨＣＶ基因组Ｃ区抗原基因Ｃ２６９／８３１,并通过ＰＣＲ得到了３个表达片段Ｃ８３１、Ｃ８０１和Ｃ５８７。测定Ｃ２６９／８３１基因的全序列后发现,中国人ＨＣＶ湖南分离株与ＨＣＶ－Ⅰ型株ＨＣＶ－ＵＳ和Ⅱ型株ＨＣＶ－ＢＫ在该基因区段的核苷酸／氨基酸序列的同源性,分别为９０．３％／９４．６％和９５．２％／９４．６％。利用原核高效表达载体ｐＢＶ２２０在大肠杆菌中有效地表达了非融合的Ｃ区抗原基因重组蛋白ＣＬ、ＣＭ和ＣＳ。通过免疫筛选法及Ｗｅｓｔｅｍ印迹法对约占菌体可溶性蛋白１１％的表达产物进行了鉴定。采用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和盐析处理表达产物,再进行离子交换层析纯化,得到可用于检测ＨＣＶ血清抗体的核壳蛋白（Ｃ）抗原。通过不同分子量抗原的表达,发现由Ｃ区Ｎ端８９个氨基酸组成的多肽ＣＳ其抗原性与由１５８或１６８个氨基酸组成的多肽ＣＭ或ＣＬ相同,但抗原的稳定性和表达量显著优于后两种抗原。本研究为研制ＨＣＶ抗体诊断试剂盒奠定了重要基础。     

用核酸免疫技术制备抗丙肝病毒C区单克隆抗体

用丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１区真核表达质粒ｐｃＤＮＡ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１按４００ｕｇ／只剂量免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,１４周后同一剂量再加强免疫一次。加强免疫后２周,在５０％ＰＥＧ１４５０介导下将脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞（５１）融合。实验结果融合率达５４．３％（３１３／５７６）。阳性率为５．４％（１７”３１３）。克隆化后得到６株稳定分泌抗丙肝病毒Ｃ区单克隆抗体杂交瘤细胞株。这６株杂交瘤均产生ＩｇＭ抗体,接种ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后产生腹水的效价为１６４－１３２０（ＥＬＩＳＡ）。     

丙型肝炎病毒E2基因DNA免疫实验动物研究

将编码丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２蛋白４１７～７５０位氨基酸的ＤＮＡ片段　克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ　３．１（－）中的ＣＭＶ　ＩＥ启动子下游,构建成ＨＣＶ　Ｅ２重组真核表达质粒　ｐｃＥ２。ＥＬＩＳＡ法检测ｐｃＥ２　ＤＮＡ免疫兔血清中的Ｅ２抗体变化和维持规律,结果显示免疫２０ｄ已有　抗体产生,３０ｄ后开始进入高峰,４０ｄ时达到最高值,至第９０ｄ抗体水平保持平稳,抗体滴度　达到１∶１６００左右。流式细胞计数仪（ＦＡＣＳ）检测ｐｃＥ２　ＤＮＡ免疫鼠ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞变　化情况,与注射空载体ｐＣＤＮＡ３．１（－）的阴性鼠相比,ＣＤ４＋淋巴细胞水平略有上升,ＣＤ８＋　细胞水平有较大升高,增幅达３５．４６％。免疫组化检测结果显示注射ｐｃＥ２的小鼠组织中有明显　的阳性着色,而注射ｐｃＤＮＡ３．１（－）的对照组小鼠免疫组化结果为阴性。以上结果表明：ｐｃＥ２　在实验动物内表达出的ＨＣＶ　Ｅ２蛋白可以引起免疫动物的体液免疫应答和细胞免疫应答,尤其　是ＭＨＣ－１限制性杀伤性ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞水平的提高对清除　病毒是十分有利的,因此ＨＣＶ　Ｅ２　ＤＮＡ免疫有可能成为预防和治疗ＨＣＶ感染的一条新途径。     

丙型肝炎病毒基因组C区和NS3区基因cDNA的融合及其在大肠杆菌中的表达与初步应用

通过逆转录（ＲＴ）－聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从中国人丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）携带者的血清中扩增并克隆到２段ｃＤＮＡ片段,即ＨＣＶ基因组Ｃ区抗原基因Ｃ８３１ｃＤＮＡ片断（约５３０ｂｐ）和ＮＳ３区抗原基因Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段（约８６０ｂｐ）。Ｃ３３ｃｃＤＮＡ片段同Ｃ８３１ｃＤＮＡ片段经连接　　　肽Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ连接成为基因嵌合体Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１（约１４００ｂｐ）。Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１基因嵌合体同温控型原核表达载体ｐＢＶ２２０重组,构建成表达质粒ｐＢＶ／Ｃ３３ｃ－Ｃ８３１,并在大肠杆菌细胞中获得了重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ的表达。通过酶切分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹法,对约占菌体可溶性蛋白９％的表达产物做了鉴定。采用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００和盐析处理,获得粗提表达产物。粗提的表达产物经尿素裂解和离子交换层析纯化,得到可用于检测抗ＨＣＶ核壳蛋白和抗ＮＳ３区抗体的重组嵌合抗原Ｃ３３ｃ－ＣＬ。对Ｃ３３ｃ－ＣＬ做抗原性分析发现,它同时具有完整的Ｃ３３ｃ抗原和Ｃ２２抗原的免疫反应活性,完全能替代单纯的Ｃ３３ｃ和Ｃ２２抗原。该嵌合抗原在血清学诊断中有重要的应用价值,可望成为新一代ＨＣＶＥＩＡ诊断试剂的优选抗原。