中华蜜蜂性信息素结合蛋白ASP1的原核表达及配基结合特性分析

【目的】研究中华蜜蜂Apis cerana cerana信息素结合蛋白ASP1与蜜蜂信息素及某些植物挥发物分子的结合功能。【方法】构建中蜂ASP1的原核表达载体, 对其进行重组蛋白的诱导表达和分离纯化, 并得到具有生化活性的中蜂ASP1重组蛋白, 最后以1-NPN作为荧光报告探针, 通过荧光竞争结合实验研究中蜂重组ASP1蛋白与蜜蜂信息素及其他气味分子的结合功能。【结果】在22种潜在信息气味物质中, 有7种与中蜂ASP1有较强的结合能力, 能将1-NPN的相对荧光强度降至50%以下。其中发现蜂王信息素两种成分对 羟基苯甲酸甲酯和香草醇的竞争能力最强, 可分别引起1-NPN相对荧光值下降99.31%和95.50%, 解离常数K_D分别为13.39和98.44 μmol/L; 而与除蜂王信息素外的其他信息素如幼虫信息素和工蜂信息素等分子均不结合。此外中蜂ASP1对于水杨酸甲酯、 苯乙醛、 3, 4-二甲基苯甲醛4-烯丙基藜芦醚和β-紫罗兰酮等5种植物挥发物质能产生强度不一的结合。【结论】中蜂信息素结合蛋白ASP1对蜂王信息素具有非常强的特异性, 同时也能结合某些植物挥发性气味分子, 暗示中蜂ASP1是一种以蜂王信息素识别为主要功能、 植物挥发物识别为次要功能的多功能信息素结合蛋白。     

家蚕化学感受蛋白BmCSP4表达谱及结合特性分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫体内存在的一类主要识别和运载非挥发性的气味分子和化学刺激物的可溶性蛋白。本研究运用半定量RT-PCR方法分析了BmCSP4的时空及组织表达谱。结果表明： BmCSP4在家蚕Bombyx mori各发育阶段均表达, 但表达量从4龄到蛹期逐渐减少, 且在雌成虫头部、 胸部和腹部表达量较少。用1-NPN作为荧光探针, 测定了15种外源配基与BmCSP4蛋白的结合特性, 结果显示： 仅芳香醛类和芳香酮类化合物在浓度10 μmol/L能将1-NPN从BmCSP4中替换50%, 苯甲醛解离常数为3.20 μmol/L, 对甲氧基苯甲醛解离常数为2.24 μmol/L, 2-戊基-3-苯丙基-烯醛解离常数为2.88 μmol/L, 1-苯基-1-丁酮解离常数为2.04 μmol/L, 苯乙酮解离常数为2.52 μmol/L。据此推测, BmCSP4在不同的发育阶段执行不同的生理功能, 并可能参与对芳香醛、 芳香酮类气味识别过程。     

中华蜜蜂信息素结合蛋白OBP10的基因克隆、原核表达和配基结合特性分析

【目的】气味结合蛋白在中华蜜蜂Apis cerana cerana嗅觉系统中起到重要作用,本实验拟研究中华蜜蜂一个新的信息素结合蛋白OBP10及其与蜜蜂信息素以及蜜源开花植物挥发物的结合特性。【方法】本实验通过RT-PCR扩增获得OBP10基因全长(Gen Bank登录号:KP717060.1),以p ET-30a构建原核表达载体,并以Ni2+琼脂糖柱进行重组蛋白表达和分离纯化,在N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子下利用荧光光谱法体外研究重组Acer OBP10与多种候选化学配基的结合特征。【结果】经多序列联配分析,发现Acer OBP10的多个同源基因均为信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)。配基结合特性分析显示,Acer OBP10对14种候选配基中的蜂王信息素成分对羟基苯甲酸甲酯(HOB)竞争力最大,相对荧光可降至6.06%,解离常数11.04μmol/L;进一步表明Acer OBP10属于一个新的中蜂PBPs。此外,Acer OBP10也能和包括工蜂信息素(香叶醇和橙花醇)、报警信息素(2-庚酮和乙酸异戊酯)等蜜蜂信息素以及蜜源开花植物挥发物之一的β-紫罗兰酮结合,表明Acer OBP10可能是一种以信息素结合为主的多功能结合蛋白。【结论】Acer OBP10是中蜂一个新的信息素结合蛋白,与此前我们鉴定的蜂王信息素结合蛋白Acer ASP1相比,Acer OBP10对蜜蜂信息素的结合谱更为广泛,这些结果将对进一步研究中华蜜蜂信息素识别和传递提供理论基础,对于深入了解中华蜜蜂嗅觉影响生理功能的行为机制具有重要意义。     

中红侧沟茧蜂化学感受蛋白MmedCSP1的结合特征

化学感受蛋白是一类存在于昆虫化学感受器中的可溶性蛋白, 被认为与昆虫识别外界化学信息有关。本研究使用pGEX-4T-1表达载体在BL21 (DE3)异源表达系统中表达中红侧沟茧蜂Microplitis mediator化学感受蛋白MmedCSP1, 并通过亲和层析法纯化得到去表达标签的MmedCSP1;使用bis-ANS作为荧光配基, 在荧光分光光度计上研究它与50种气味标样的结合特征, 从而得到此类化学感受蛋白在中红侧沟茧蜂嗅觉识别中识别气味的种类。结果表明: MmedCSP1只能与水杨酸甲酯、戊烷、罗勒烯、β-紫罗兰酮、3, 4-二甲基苯甲醛、2-己酮和叶醇结合。但只有脂类化合物β-紫罗兰酮能在浓度为1 mmol/L下将bis-ANS从MmedCSP1中替换50%, β-紫罗兰酮与MmedCSP1的结合常数为16.89 μmol/L。这些结果提示MmedCSP1参与中红侧沟茧蜂对水杨酸甲酯、戊烷、罗勒烯、β-紫罗兰酮、3, 4-二甲基苯甲醛、2-己酮和叶醇等气味的识别过程, 且在不同气味中的识别过程中对于气味的运输能力有差异。     

草地螟普通气味结合蛋白Ⅰ（Lsti-GOBP1）蛋白表达纯化及结合特性分析

气味结合蛋白在昆虫对寄主挥发性气味识别过程中有着重要的生理功能。本研究通过对草地螟Loxostege sticticalis L. 普通气味结合蛋白Ⅰ（Lsti-GOBP1）进行克隆及原核表达的基础上, 分离纯化得到体外重组的Lsti-GOBP1蛋白。并利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN）作为荧光探针研究了Lsti-GOBP1蛋白与醇类、 醛类、 酯、 烯等50种气味标样的结合特性, 结果表明Lsti-GOBP1可与其中35种气味化合物结合, 但只有1-己醇、 1-庚醇、 肉桂醛和莰烯4种气味标样能在20 μmol/L浓度（探针与蛋白结合的饱和浓度值）下将1-NPN从Lsti-GOBP1中替换50%, 其结合常数分别为8.997, 7.283, 7.289 和9.814 μmol/L。据此可以得出, Lsti-GOBP1蛋白的气味物质结合谱很广, 同时具有较强的特异性, 其中1-己醇、 1-庚醇、 肉桂醛、 莰烯等化合物在草地螟识别寄主植物气味物质的过程中起重要作用。     

绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP7的表达及气味结合特性

气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs) 在昆虫嗅觉识别中起着重要的作用, 尤其是在运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体(olfactory receptors, ORs)的过程中发挥关键作用。明确OBPs在昆虫同外界进行信息交流过程中的作用有利于阐明昆虫嗅觉识别的机制, 同时可为利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治奠定理论基础。本研究克隆了一个绿盲蝽Apolygus lucorum (Meyer-Dür)气味结合蛋白AlucOBP7基因（GenBank登录号: JQ675724）, 并进行了原核表达, 以1-NPN为荧光探针采用荧光竞争结合实验研究了AlucOBP7蛋白和10种棉花挥发物及 6种性信息素类似物的结合能力。结果表明： 在10种棉花挥发物中, AlucOBP7能够和2 己酮及水杨酸甲酯有效结合, 结合常数分别为55.13 μmol/L和28.26 μmol/L。在6种盲蝽性信息素类似物中, 4-氧代-反-2-己烯醛和AlucOBP7 具有较强的结合能力, 结合常数为23.14 μmol/L。丁酸乙酯、 丁酸丁酯及己酸己酯也能够和AlucOBP7 有效结合, 但结合能力中等, 结合常数分别为30.58, 39.26和35.81 μmol/L。初步推测, AlucOBP7 可能是绿盲蝽性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins, PBPs), 并在感受性信息素和植物挥发物的过程中发挥双重功能。     

斑蝥素对草地贪夜蛾Sf9细胞膜完整性和膜电位的影响

为明确斑蝥素对昆虫细胞膜的作用及其机理, 本研究利用草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的卵巢细胞系Sf9细胞作为实验材料, 采用透射电子显微技术(transmission electron microscope , TEM)、 激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)结合荧光探针FDA/PI及DiBAC4(3)技术研究斑蝥素(cantharidin, CTD)对Sf9细胞膜完整性及膜电位（membrane potential, MP）的影响。结果表明： 32 μmol/L CTD处理6 h和12 h后, 电镜观察均未发现细胞膜结构破损; FDA/PI染色后, 32 μmol/L CTD处理0.5 h后细胞FDA荧光强度比对照显著降低(P<0.05), 碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色的细胞比例与对照无显著性差异(P≥0.05)。32 μmol/L CTD处理140 s后即引起MP发生显著性去极化(P<0.05); 64 μmol/L CTD处理瞬时MP发生显著性去极化(P<0.05); 32 μmol/L CTD处理3 h内及64 μmol/L CTD处理2 h 内MP仍保持显著性去极化(P<0.05), 之后去极化程度降低; 32 μmol/L CTD处理6 h及64 μmol/L CTD处理3 h时MP去极化与对照组相比已无显著性差异(P≥0.05)。结果说明, CTD处理短时间内可引起Sf9细胞膜电位去极化并维持一段时间, 同时导致细胞活性发生不可逆下降, 但未对细胞膜结构完整性产生破坏。     

梨小食心虫气味结合蛋白GmolOBP3的cDNA克隆、表达谱及结合特性分析

【目的】为了更好地了解昆虫气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在梨小食心虫Grapholita molesta（Busck）嗅觉识别中的作用,并明确其与寄主挥发物的结合特性。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆梨小食心虫OBP基因;采用RT-PCR和实时定量PCR对该基因在成虫不同组织和羽化后不同日龄成虫中的表达情况进行了测定;以N-phenyl-1-naphthylamine（1-NPN）为荧光探针,采用荧光竞争结合试验对GmolOBP3蛋白的结合特性进行了分析。【结果】得到梨小食心虫一个新的气味结合蛋白基因,命名为GmolOBP3（GenBank登录号：KF395363）。GmolOBP3开放阅读框全长492 bp,编码163个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为18.72 kDa和4.93,呈酸性,具有典型的6个半胱氨酸位点。GmolOBP3在雌、雄成虫触角和腹部均有表达,成虫在羽化后5 d内,雌蛾触角中GmolOBP3表达量随羽化后日龄而增加,但雄蛾在羽化后第5天触角中 GmolOBP3表达量显著降低。通过构建GmolOBP3原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达并获得了GmolOBP3重组蛋白。荧光竞争结合实验对GmolOBP3蛋白与16种寄主挥发物及4种性信息素类似物的结合力发现,在供试的4种梨小食心虫性信息素类似物中,GmolOBP3蛋白与反-8-十二碳烯醋酸酯和十二烷-1-醇不结合,而与顺-8-十二碳烯醋酸酯和顺-8-十二碳烯醇结合,但结合力较弱,结合常数分别为83.00和103.70 μmol/L;与16种寄主挥发物结合能力也不强,其中结合最强的是β 紫罗酮,结合常数为49.36 μmol/L。【结论】由此推断,GmolOBP3具有选择性识别和结合各种配基的特性。     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因Acer-CSP1克隆与表达特征分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫化学感受系统中重要的组成部分之一。本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白基因Acer-CSP1, 其核苷酸全长351 bp （GenBank登录号为FJ157352）, 编码116个氨基酸残基, 预测蛋白分子量为13.85 kD, 等电点为4.89, 且含有4个保守的半胱氨酸残基, 均符合昆虫CSPs的一般特征, 且与意蜂CSP1基因具有99.1%的相似性, 与其他昆虫也有45.3%~68.0%的相似性。利用2^-ΔΔCt法及绝对定量法的real-time PCR技术对Acer-CSP1在中蜂不同器官表达特征进行了研究, 得出的一致结论为Acer-CSP1显著水平地高丰度表达于中华蜜蜂触角, 其次大量表达于头部。由于触角为中华蜜蜂最主要的嗅觉器官, 而头部则具有发达的感觉神经系统和味觉系统, 这也提示Acer-CSP1极有可能参与中华蜜蜂的嗅觉以及其他化学感受功能。     

甘草次酸对甲状腺癌细胞SW579 凋亡的影响及其机制*

目的:研究甘草次酸对甲状腺癌细胞SW579凋亡的影响及其可能的机制。方法:甲状腺癌细胞SW579分成4组,每组设置5个复孔,对照组为含10%胎牛血清的DMEM培养基;低浓度甘草次酸组为含浓度50 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培养基;中浓度甘草次酸组为含浓度100 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培养基;高浓度甘草次酸组为含浓度200 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培养基;各组在5%的二氧化碳培养箱中孵育24 h和48 h后,通过Annexin V / PI双标记流式细胞术检测甲状腺癌细胞SW579的凋亡比例,蛋白质印迹法检测检PI3K、AKT1、p-AKT蛋白的表达。结果:与对照组比较,孵育24 h及48 h后,50 μmol/L甘草次酸组凋亡细胞比例有所升高,AKT1、p-AKT、PI3K蛋白的相对表达量变化不明显,均无显著性差异(P＞0.05);100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸组的凋亡细胞比例均显著升高,AKT1、p-AKT蛋白的相对表达量均明显降低 (P＜0.05)。结论:100 μmol/L和200 μmol/L的甘草次酸可通过抑制AKT蛋白的表达促进甲状腺癌细胞SW579 凋亡。     

中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析

[目的]气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制.[方法]通过qRT-PCR测定OBP14在20日龄中华蜜蜂成年工蜂...     

中华蜜蜂mrjp1 cDNA的克隆及其序列分析

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)8日龄工蜂头部cDNA文库,利用中蜂基因组的mrjp3部分基因片段作为杂交探针,采用DIG标记筛选cDNA文库,获得mrjps阳性克隆120个;对阳性克隆进行PCR扩增和测序,通过NCBI的BLAST序列比对,获得12个与印度蜂(Apis cerana india)、西方蜜蜂(Apis mellifera L.)mrjp1基因同源的中蜂mtjp1 cDNA片段,并进一步对中华蜜蜂mrjp1的cDNA全序列进行测定和分析。序列比对分析表明,东方蜜蜂(Apis cerana)与西方蜜蜂mrjp1的cDNA序列相似性为93．78％,中华蜜蜂与印度蜂的相似性高达99．36％,这一结果从分子水平证实中华蜜蜂与印度蜂有较近的共同祖先,而东方蜜蜂与西方蜜蜂的亲缘关系较远。     

中华蜜蜂气味结合蛋白基因OBP4的分子特性及时空表达

气味结合蛋白OBPs在蜜蜂识别气味分子和生理反应的过程中起到了十分重要的作用。本研究通过利用生物信息学软件预测分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白基因OBP4(AcerOBP4)编码的蛋白理化特性和结构特征;采用MEGA 5.2软件中的邻位相连法(Neighbor-joining, NJ)构建AcerOBP4及其它昆虫OBPs的系统发育树;通过qRT-PCR技术分析AcerOBP4在中华蜜蜂的哺育蜂、采集蜂和1日龄工蜂各组织的表达情况。结果表明,中华蜜蜂和意大利蜜蜂Apis melliferaOBP4(AmelOBP4)氨基酸同源性为78%,AcerOBP4在中华蜜蜂的触角表达量最高,其次是足和头部组织表明该基因与蜜蜂的嗅觉行为密切相关。此外,AcerOBP4在蜜蜂脑部有一定的表达,但是在腹部组织表达量很低。该研究结果丰富了蜜蜂OBPs表达特性的研究数据,同时也为继续深入研究OBP4在中华蜜蜂中是否影响嗅觉行为提供了基础。     

中华蜜蜂的欧洲幼虫腐臭病病原研究

采用中华蜜蜂Apis cerana cerana F.临床自然发病的欧洲幼虫腐臭病(European Foulbrood, EFB)幼虫,对其病原体进行了分离鉴定。结果表明：中华蜜蜂EFB的病原系蜂房蜜蜂球菌Melissococcus pluton。该菌为革兰氏阳性的兼性厌氧菌,形态学及染色特性、致病性试验、血清学试验和细菌DNA G+C mol%试验均证明中华蜜蜂和西方蜜蜂的EFB病原属于同属的蜂房蜜蜂球菌。生理生化特性结果与国外的早期研究结果相近似。该试验为不同地理位置、不同种寄主间蜂房蜜蜂球菌的遗传差异的研究,以及中华蜜蜂EFB病的防治学研究打下基础。     

中蜂的传粉作用研究

蜜蜂授粉在维持自然生态系统的平衡与发展过程中发挥着重要作用,也与农业生态系统中农作物的增产及品质提升有着密切联系.中蜂(中华蜜蜂Apis cerana cerana)是我国特有的蜜蜂遗传资源,广泛分布于除新疆以外的华南、中南、西南、西北、华北及东北等地区,野生资源丰富、民间饲养基础好,种群数量大,是本土开花植物的重要传...     

意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)与中华蜜蜂(Apis cerana ceraca)的生态位比较

为了明确中华蜜蜂和意大利蜜蜂在皖南山区生态适应性,研究两种蜜蜂的食物生态位、时间生态位和空间生态位及其差异,结果是中蜂与意蜂食物(蜜源植物)资源生态位宽度分别是 0.923、0.765,中蜂对蜜源植物采集喜好性差异小,而意蜂差异大,中蜂对意蜂生态位重迭为0.160,中蜂对意蜂生态位相似性为0.755;油菜花期,中蜂与意蜂时间资源生态位宽度分别是0.879、0.801,枇杷花期,分别是0.760、0.677,中蜂与意蜂的空间资源生态位宽度分别是0.797、0.670.中蜂3种生态位宽度均大于意蜂,中蜂三维生态位值是意蜂的1.61倍和1.57倍.表明中蜂在皖南山区生态适应性比意蜂强.     

雌性中华蜜蜂胚胎发育组织形态观察

【目的】探索雌性中华蜜蜂Apis cerana cerana胚胎组织发育过程。【方法】在正常蜂群中,用蜂王产卵控制器将蜂王限制在工蜂巢房的巢脾上产卵1 h,蜂王在工蜂巢房中产下的卵是受精的雌性卵,将有卵的巢脾割下放入恒温恒湿箱中培养。恒温恒湿箱中样本所在的位置温度严格控制在35±0.2℃,相对湿度75%±5%。把限王产卵1 h内获得的蜜蜂卵作为0 h胚胎,每隔4 h取样一次。采用石蜡切片技术,对二倍体雌性中华蜜蜂胚胎发育过程进行观察。【结果】根据胚胎发育过程中的形态特征,雌性中华蜜蜂胚胎发育过程划分为4个阶段:(1)卵裂期(0-12 h),活质体迁移到卵的表面,呈双层排列;(2)胚盘形成期(12-28 h),活质体排列为单层,并形成细胞膜;(3)胚层形成期(28-40 h),侧板覆盖中板,两者在腹中线愈合;(4)胚胎器官系统形成期(40-68 h)。【结论】本研究明确了雌性中华蜜蜂胚胎发育过程的形态变化,进行了阶段划分并明确了各发育阶段的形态特征及对应的发育时间。本项研究结果有助于开展与蜜蜂胚胎发育的相关蜜蜂生态学、发育生物学、营养学等课题深入研究。     

中华蜜蜂精子介导egfp基因转移

中华蜜蜂Apis cerana cerana是一种真社会性昆虫,也是我国重要的经济昆虫。本实验目的是为了检测精子是否可以作为载体将外源egfp基因介导转入中华蜜蜂。首先将雄蜂精子与线性化的质粒DNA共浴,然后通过人工授精技术将精子导入处女王,再对实验蜂群后代进行分析。结果显示EGFP蛋白在一群实验组蜂的1～2日龄小幼虫中表达较强,能检测到0.01%～0.02%荧光阳性小幼虫个体;通过PCR和RT-PCR技术分析,证实转入的外源egfp基因获得表达。实验结果表明精子载体法能够用于中华蜜蜂外源基因的转移和表达。