逆转录病毒载体用于基因治疗的安全性

有复制能力的逆转录病毒感染,插入突变,无关序列进入靶细胞是基因治疗潜在的危险,但造成实际危害的可能性极小,完善逆转录病毒载体系统的设计,提高检测有复制能力的病毒的灵敏度将进一步保证基因治疗的安全性。     

逆转录病毒载体的应用现状及前景展望

着重介绍逆转录病毒载体在基因治疗、外源基因表达、RNA干扰三方面的最新应用现状并对其应用前景进行展望,同时介绍了逆转录病毒载体存在的应用缺陷。     

基因治疗所用的逆转录病毒载体系统

基因治疗所用的逆转录病毒载体系统徐铿,陈诗书（上海第二医科大学生物化学教研组,２０００２５）关键词基因治疗,逆转录病毒载体,包装细胞八十年代初发展的以逆转录病毒为基础的基因转移系统对今天基因治疗的实现起了关键性的作用。目前近５０个基因治疗计划绝大部分...     

重组逆转录病毒载体GTK的构建及HyTK基因转移的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物９（１,３－二羟基－珍氧基－甲基）鸟嘌呤选择性地杀死肿瘤细胞,将ＨｙＴＫ基因替换逆转录病毒载体ＧｌＮａ中的ｎｅｏ基因,构建成重组逆转病毒载体ＧＴＫ,转染混合包装细胞（双噬性ＰＡ３１７细胞和单噬性ＧＰ＋Ｅ－８６细胞）,通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒,用该重组病毒转染不鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞,用ｙｇｒｏｍ     

一种新的逆转录病毒载体—HIV载体

一种新的逆转录病毒载体——ＨＩＶ载体赖冠华陈诗书（上海第二医科大学人类基因治疗研究中心,上海２０００２５）关键词逆转录病毒载体ＨＩＶ载体逆转录病毒载体具有能有效地将外源基因整合进靶细胞基因组、长期表达外源基因以及病毒包装过程简单的特点,因此成为基因治...     

逆转录病毒载体构建的hNT-3基因在大鼠成纤维细胞中的表达

为了检验重组逆转录病毒对体外培养细胞的感染能力和效率 ,用逆转录病毒载体构建的人神经营养因子 3(pLXSN NT3)感染大鼠原代成纤维细胞 ,经G4 18筛选获得了稳定整合有外源hNT 3的工程细胞株 .RT PCR证实了外源基因hNT 3已整合到宿主细胞基因组 ,并可合成其mRNA ;PCR检测方法证明细胞株不含具有感染能力的病毒 ;Western印迹证明了细胞能正确表达hNT 3;大乳鼠背根神经节检测了细胞上清液中的NT 3生物活性 .体外感染实验的成功为进一步进行基因治疗动物实验打下了基础     

肿瘤细胞对腺病毒载体转染的敏感性研究

带有基因LacZ的5型缺陷性腺病毒感染肿瘤细胞,X－gal染色,检测腺病毒对肿瘤细胞的转染率。结果显示,随着病毒感染复数量（multiplicityofinfection,m.o．i）的增加,转染率也增高,且无细胞毒作用。各种肿瘤达到100％转染所需病毒量是不同的,人类肿瘤细胞系100％转染所需的m.o．i分别是：Hela细胞为100,GRC肾癌细胞为200,Hep-2喉癌细胞为200,鼠肿瘤所需病毒量较大,Lewis肺癌细胞为500,BST膀胱癌细胞为600。说明不同肿瘤细胞对腺病毒载体转染的敏感性是不同的。     

逆转录病毒载体在血友病A基因治疗中的研究进展

基因治疗是彻底治愈血友病A的最理想方法,逆转录病毒是最为常用的载体之一,本文对逆转录病毒在血友病A基因治疗中的研究进展作一综述。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７,经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆,用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度,获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６,得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,经ＰＣＲ检测,ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性,结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降,基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子微球制剂治疗肿瘤的研究

目的：评价粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM—csF）微球剂型在肿瘤动物模型治疗作用。方法：建立肿瘤动物模型,微球剂型对该肿瘤模型治疗效果考察及毒性评价,同时与市售的注射水溶液剂型进行比较。结果：微球剂型和市售水溶液注射剂型同剂量对肿瘤模型治疗效果,微球剂型的效果明显好于市售的;同时微球剂型的毒性也小于市售的。结论：粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子微球能提高GM—CSF治疗效果,同时降低毒性。     

逆转录病毒介导的HSV－tk在肿瘤基治疗中的应用

本实验将ＨＳＶ－ｔｋ基因构建在逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮｎｅｏ上,经ＰＡ３１７包装后,筛选出５ｘ１０￣５ｐｆｕ／ｍｌ的ＴＫ包装细胞。用该细胞培养上清感染体外培养细胞,并用Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ－ＧＣＶ处理,可以对增殖的细胞产生细胞毒害作用。细胞增殖速度越快,细胞毒害作用越强。在体内实验中,将ＴＫ细胞直接注射到移植瘤中或与瘤组织悬液混合接种同种小鼠。再用ＧＣＶ治疗,对肿瘤有较强的生长抑制作用。     

慢病毒载体与造血干细胞介导的基因治疗

慢病毒载体不仅能感染造血干细胞 (HSCs) ,使携带的目的基因整合至HSCs基因组内 ,且能利用病毒携带的调控元件 ,使目的基因随HSCs细胞特异性表达 ,因此是一种有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具。主要对慢病毒载体基因组特点、改建过程、慢病毒对干细胞的感染能力、慢病毒携带的目的基因在HSCs内的表达及调控等方面做了简要的综述     

重组人MCAF／GM－CSF融合蛋白表达及其生物学活性研究

利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ体外重组方法,把作为导向效应细胞到靶部位的单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）进行基因融合,置于ｐＢＶ２２０载体的λＰＲＰＬ串联启动子下游,构建了ＳＤ序列与ＡＴＧ之间含有不同核苷酸组成的重组质粒ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３。ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３的翻译起始区都不存在稳定的二级结构,但ＤＨ５α（ｐＭＧ０２、ＤＨ５α（ｐＭＧ０３）的表达水平远远高于ＤＨ５α（ｐＭＧ０１）,ＤＨ５α（ＰＭＧ０１）几乎没有表达。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,它能分别与ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ抗体发生特异反应。生物学活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性和维持ｈＧＭ－ＣＳＦ依赖的ＴＦ１细胞生长的特性,说明ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ的生物学功能是相容的．     

用人DNA介导的基因转移修复中国仓鼠细胞的HPRT缺陷

 中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变和6-巯基鸟嘌呤(6-TG)选择,得到稳定的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷细胞株,酶活性仅为野生型的6.5％。用磷酸钙共沉淀法和电脉冲法向HPRT-细胞转移人宫颈癌细胞(HeLaS_3)基因组DNA,纠正了CHO细胞的HPRT缺陷。酶活性提高了6.9倍,达到野生型的45％。用Alu序列探针进行分子杂交,证实经过基因转移并连续传代15次以上的受体细胞中含人DNA序列。表明人的有关基因已稳定地整合到CHO细胞的染色体中。     

肝细胞特异性基因治疗载体的构建及活性研究

以细胞膜穿透肽 (Penetratin)基因为主要模板序列 ,融合肝细胞膜受体结合蛋白的DNA序列 ,设计一段肝细胞基因治疗载体的特异基因序列 ,构建并表达了肝细胞特异性载体体系及 3种对照体系。然后进行肝细胞的穿膜实验 ,细胞荧光显色结果提示肝细胞特异性载体体系可以有效地介导外源蛋白EGFP的基因进入肝细胞 ,并在肝细胞内表达。结论提示 ,所构建的载体体系有可能为肝细胞基因治疗提供一种新型的非病毒基因治疗载体。     

活体电穿孔法基因导入技术

活体电穿孔法(invivoelectroporation)可将外源基因有效导入靶组织或器官,导入效率较高,并且可在多种组织器官上应用。近年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日趋显著,是一种很好的活体基因导入方法 。     

Human Ovarian Cancer Stroma Contains Luteinized Theca Cells Harboring Tumor Suppressor Gene GT198 Mutations

Ovarian cancer is a highly lethal gynecological cancer, and its causes remain to be understood. Using a recently identified tumor suppressor gene, GT198 (PSMC3IP), as a unique marker, we searched for the identity of GT198 mutant cells in ovarian cancer. GT198 has germ line mutations in familial and early onset breast and ovarian cancers and recurrent somatic mutations in sporadic fallopian tube cancers. GT198 protein has been shown as a steroid hormone receptor coregulator and also as a crucial factor in DNA repair. In this study, using GT198 as a marker for microdissection, we find that ovarian tumor stromal cells harboring GT198 mutations are present in various types of ovarian cancer including high and low grade serous, endometrioid, mucinous, clear cell, and granulosa cell carcinomas and in precursor lesions such as inclusion cysts. The mutant stromal cells consist of a luteinized theca cell lineage at various differentiation stages including CD133⁺, CD44⁺, and CD34⁺ cells, although the vast majority of them are differentiated overexpressing steroidogenic enzyme CYP17, a theca cell-specific marker. In addition, wild type GT198 suppresses whereas mutant GT198 protein stimulates CYP17 expression. The chromatin-bound GT198 on the human CYP17 promoter is decreased by overexpressing mutant GT198 protein, implicating the loss of wild type suppression in mutant cells. Together, our results suggest that GT198 mutant luteinized theca cells overexpressing CYP17 are common in ovarian cancer stroma. Because first hit cancer gene mutations would specifically mark cancer-inducing cells, the identification of mutant luteinized theca cells may add crucial evidence in understanding the cause of human ovarian cancer.     

基因转移与肿瘤基因工程疫苗

综述了近年来有关利用基因转移技术修饰肿瘤细胞制备肿瘤基因工程疫苗的最新研究进展,着重阐述了逆转录病毒载体介导的基因转移及其安全性;归纳了目前可用于肿瘤基因工程疫苗的各种目的基因的特点及作用并对这类肿瘤疫苗制备过程中所存在的问题进行了分析.     

HA 纳米载体转hGM-CSF 基因的HepG2 疫苗的抗肿瘤活性研究

目的:评价HA纳米载体转hGM-CSF基因的HepG2疫苗的抗肿瘤活性。方法:SCID小鼠20只腹腔内注射健康志愿者外周血淋巴细胞(1×107/ml)1.0 ml,同时背部皮下接种人肝癌HepG2细胞(1×107ml)0.2 ml。当皮下移植瘤体积长至100 mm3时,随机分四组:Ⅰ组,60Co照射的转染GM-CSF基因的HepG2细胞组,Ⅱ组,60Co照射的HepG2细胞组,Ⅲ组,生理盐水组,Ⅳ组,接种前,每组5只。MTT法检测各组小鼠脾细胞CTL活性,ELISA法检测血清IL-4和IL-12的水平。结果:转染GM-CSF基因的HepG2疫苗组小鼠脾细胞CTL活性明显高于其余组(P<0.05);同时血清Th1类细胞因子IL-12的水平明显升高(P<0.05),而Th2类细胞因子IL-4的水平无统计学意义(P>0.05)。结论:HA纳米载体转hGM-CSF基因的HepG2疫苗可刺激机体产生特异性免疫反应。