HSV—1感染人成纤维细胞中HTRP基因的生物信息学分析

依靠生物信息技术对HSV I型病毒刺激KMB－17细胞后克隆得到的差异基因HTRP和其编码蛋白序列的特征进行了分析和预测,初步推测了该基因的转录调控序列和编码蛋白的结构特点,为深入研究病毒刺激后细胞基因表达所编码序列的功能提供了基本数据。     

HSV-1感染细胞中HTRP基因的克隆及表达纯化

在对单纯疱疹病毒1型（HSV－1）感染KMB－17细胞后的早期基因反应的研究中,从HSV－1感染后细胞特异性cDNA文库中筛选出一个1381bp基因一HTRP,基因测序分析表明为与HSV－1感染相关基因（GenBank登录号：AF450482）,含有完整的ORF框架,cds全长924bp,编码308个氨基酸。构建了pGEX-HTRP表达质粒,在大肠杆菌B21加获得了较高的表达,采用Glutathione Sepharose4B进行亲和纯化后获得较高纯度的HTRP蛋白。用该蛋白免疫小鼠后制备的特异抗血清,在蛋白印迹实验中表现出抗体的特异性。     

生物信息学研究新基因LRP15

为了利用生物信息学探索网上克隆基因与预测基因功能的新方法,首先用一段1.8kbDNA片段的人类EST数据库中进行电子杂交并对相互重叠的EST片段组装,通过引物设计进行cDNA末端快速扩增,以高通量基因组序列（HTGS）数据库及SAGE库为基础,进行染色体定位及组织表达分析。通过DAS及RPS－BLAST程序预测其蛋白质结构及功能。结果显示,LRP15 cDNA全长1718bp,含一个780bp的开放读码框架,编码259个氨工酸,该基因定位于染色体3p24,在多种组织中表达。其编码蛋白含有N端富含亮氨酸重复序列及潜在的穿膜序列。研究表明,生物信息学是克隆与预测基因功能的有效方法;LRP15基因可能是一个参与细胞发育调控的新基因。     

普氏野马GH基因的克隆及生物信息学分析

普氏野马(Equus przewalskii)属国家Ⅰ级保护动物,是现存的马中唯一的野生亚种。生长激素(Growth Hormone, GH)是大脑垂体前叶分泌的一种多肽类激素,对动物个体的生长、发育的影响极其明显。为了更好的保护普氏野马,提高其野外生存与繁殖能力,本研究利用PCR技术首次获得了普氏野马GH基因,并利用生物信息学方法对其编码的蛋白质结构和功能进行分析和预测,旨在探明普氏野马生长激素(Growth Hormone, GH)基因的结构特点以及其编码蛋白质的结构与功能。结果显示,普氏野马GH基因所在基因组DNA全长为1 577 bp,经BLAST比对后,发现普氏野马与家马(GenBank:EU939446.1)GH基因序列相似性高达99.68%,属于同源序列。该基因编码蛋白质的氨基酸数量为152个,分子量为17 638.54 Da,理论等电点为9.01,带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为19个,正电荷残基总数(Arg+Lys)为23个,分子式为C₇₉0H₁₂₇₄N₂₁₆O₂₂₆S     

香蕉MuMADS1基因的生物信息学分析

通过筛选用采后0h和48h的香蕉果实构建的果实成熟的SSH(抑制差减杂交)文库,得到一条命名为MuMADS1长度为888bp的片段。通过互联网数据库及生物信息学分析工具对香蕉MuMADS1基因及其编码蛋白进行理化性质预测、序列与结构分析和功能预测。结果表明:MuMADS1基因编码蛋白分子式为C1171H1879N351O367S7,属于亲水的不稳定蛋白;保守结构域分析含有保守的MADS盒和半保守的K-box盒;二级结构主要是以α螺旋为主;具有多种磷酸化位点和核定位信号;同源性比较发现与许多植物的花器官决定基因具有较高的相似性,推测它们可能为同源基因,具有相似的生物学功能。     

人NR2F2基因的克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆人NR2F2(Nuclear Receptor subfamily 2,group F,member 2)基因并分析其生物学特性。[方法]根据NCBI数据库提供的人NR2F2基因序列设计其特异性引物,通过PCR扩增目的基因,并将其连接到p ET-28a载体上,然后进行酶切鉴定与DNA测序来确定人NR2F2基因克隆的正确性,再利用生物信息学在线工具分析人NR2F2蛋白的生物学特性。[结果]酶切鉴定与DNA测序结果表明人NR2F2基因开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸残基,分子量为29 162.79 Da,p I为5.96。NR2F2蛋白是主要位于细胞质和细胞核中的亲水性蛋白,不含跨膜结构域,无信号肽,其二级结构由α螺旋、无规则卷曲和延伸链构成,并且三级结构与二级结构预测结果一致。[结论]克隆获得人NR2F2基因,其编码的蛋白质属于类固醇/甲状腺激素受体超家族,α螺旋和无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件。GO注释分析表明,人NR2F2属于转录因子,参与序列特异性DNA结合、基因转录、RNA的生物合成、RNA代谢等过程。     

香蕉中Maasr1基因的生物信息学分析

目的:利用生物信息学方法对香蕉中Maasr1基因的理化性质、结构与功能进行预测,为其基因功能的研究提供线索,为下一步的实验策略提供参考。方法:用Protparam分析Maasr1编码蛋白的氨基酸序列组成、相对分子质量、等电点等理化性质;用InterProScan分析蛋白质结构域;用Scanprosite寻找Motif;用Predictprotein预测二级结构、疏水性;用Psort进行亚细胞定位;用ClustalW进行多序列比对;用Protfun分析蛋白质功能。结果:通过因特网数据库及生物信息学分析工具进行初步分析表明,Maasr1基因编码的蛋白是一种相对分子质量为16263.8、等电点为5.99的不稳定蛋白,富含Glu、Ala、His、Lys;二级结构主要是α螺旋,具有多种蛋白激酶磷酸化位点和1个豆蔻酰化位点,并具有很高的亲水性,定位于细胞核和细胞质。结论:Maasr1基因可能在植物的糖代谢、生长衰老、果实发育及非生物胁迫过程中起重要作用。     

牛DLK1基因的生物信息学分析

DLK1基因是位于DLK1-DIO3印记区域内一个父源表达的印记基因。本研究利用生物信息学方法对牛DLK1基因进行了分子进化分析、基因和蛋白质结构分析并预测了其启动子和CpG岛区域。对7种动物DLK1基因mR NA序列的分子进化分析结果显示,牛与羊的遗传距离最小,亲缘关系最近。蛋白质在线分析软件表明,DLK1蛋白由信号肽、EGF结构域以及跨膜区组成。牛DLK1基因包含5个外显子,且存在多种可变剪切体。启动子在线软件预测,牛DLK1核心启动子可能位于该基因起始密码子上游1 790~1 840 bp处。预测结果表明,人、小鼠和牛三个物种DLK1潜在的核心启动子区所处的位置具有一致性,并且三个物种的启动子区DNA序列具有高度保守性。以上研究结果为进一步阐明牛DLK1基因的生物学功能及其印记调控机理提供了参考依据。     

全雌系苦瓜ACC合成酶基因cDNA克隆及序列分析

以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为材料,根据已报道ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)保守氨基酸序列设计简并引物,采用RT-PCR技术及序列拼接,获得了全雌系苦瓜ACS基因cDNA序列,命名为Mc-ACS4(GenBank登录号:FJ459814)。该序列包含一个1 455 bp的完整开放阅读框,编码484个氨基酸,具有7个保守区;系统进化上与普通苦瓜ACS基因首先聚类,同源性达99%,二者仅有2个氨基酸差异,推测可能与全雌系苦瓜性别分化有关。     

柠条锦鸡儿CkLEA1基因克隆及表达分析

植物受到逆境胁迫后,大量逆境响应基因会被诱导表达,LEA蛋白编码基因就是与植物抗旱、抗冷等非生物胁迫密切相关的一类基因.从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一条LEA蛋白编码基因并进行了克隆.序列比对与系统进化分析显示该基因属于LEA3基因家族成员,命名为CkLEA1(GenBank登录号是KC309408).克隆得到该基因gDNA长469bp,包含两个外显子和一个内含子;cDNA长357bp,包含300bp的开放阅读框,推导编码99个氨基酸的蛋白质.利用荧光定量PCR技术对CkLEA1基因在各种逆境胁迫条件的表达情况进行初步研究表明,CkLEA1受干旱、ABA、冷、热、盐和碱等处理不同程度地诱导,推测其与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫的机制有关.     

中间锦鸡儿DHN1基因克隆及表达分析

脱水素(DHNs, dehydrins)是LEA II亚家族蛋白,在种子发育后期大量积累,并受不同逆境胁迫处理诱导表达。在中间锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一段 DHN1 序列,利用RACE技术克隆获得基因全长序列。序列比对分析表明, CiDHN1 具有开放阅读框891bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,编码297个氨基酸,含有5个Y片段和一个K片段,与CiDHN1相似性最高的为山茱萸科主教红端木(Cornus sericea),相似性为39%。系统进化分析显示CiDHN1单独聚为一支,推测该蛋白为新的功能未知蛋白。亚细胞定位结果表明CiDHN1定位在细胞质、质膜和细胞核。荧光定量PCR结果显示 CiDHN1 的表达受冷、脱水和NaCl等非生物胁迫的诱导。 CiDHN1 过量表达拟南芥后,其中表达量最强的株系对200 mmol/L的NaCl处理较为敏感。CiDHN1在中间锦鸡儿抵抗逆境胁迫中的功能有待于进一步研究。     

丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞二萜类物质合成的重要调节靶点。本研究从药用植物丹参中克隆了一条新的GGPPS基因(SmGGPPS3),基因全长2908 bp,包含一个931 bp的内含子和一个960 bp的编码序列。推测的氨基酸序列与蓖麻、橡胶、拟南芥等植物GGPPS一致性达到67%以上。实时定量PCR结果显示,SmGGPPS3基因在丹参不同发育时期不同器官中表达差异显著,同时受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导。遗传互补实验也表明,SmGGPPS3编码蛋白具有GGPP合酶的活性。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段的克隆表达及初步鉴定

通过计算机分析Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G的氨基酸序列,筛选出HSV1gG蛋白中优势抗原决定簇位点,用PCR技术扩增克隆含强抗原决定簇较集中的基因片段。将该段基因克隆至质粒表达载体pGEX4T2内,转化大肠杆菌TG1,构建成功了高效表达Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因的工程菌。用纯化的表达蛋白HSV1gGGST作抗原ELISA分析证实有较好的抗原性和特异性,显示可应用于单纯疱疹病毒感染的诊断 。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒 gD基因片段的高效表达及抗原性分析

目的 获得高表达的Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV)被膜糖蛋白gD（简称gD1）基因的工程菌。方法 通过计算机分析,筛选出疱疹病毒gD1中优势抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插入表达载体pTrxA内,转化大肠杆菌Rosetta,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。　结果　PCR扩增出约930bp的gD1编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建pTrxA-gD1重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pTrxA-gD1重组质粒的大肠杆菌Rosetta诱导后得到了高效达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr48000（Dalton）。免疫印迹结果表明表达产物具有较好的抗原性。结论　成功构建了pTrxA-gD1表达质粒,实现了成熟gD1蛋白在大肠杆菌中的高效表达,表达产物具有好的抗原性。     

硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝酸还原酶基因的克隆

硝酸盐在植物体内的积累过多已成为影响蔬菜品质并影响人类健康的重要因素。硝酸还原酶（NR）是硝酸盐代谢中的关键酶,提高其活性有利于硝酸盐的降解。为了解植物不同组织中NR的活性,用活体测定法检测了经50mmol/L的KNO₃诱导不同时间后的油菜、豌豆和番茄幼苗根茎叶中NR活性,同时为了明确外源诱导剂浓度与植物体内NR活性的关系,检测了经不同浓度KNO₃诱导2h后的矮脚黄、抗热605、小白菜和番茄叶片中的NRA。结果表明,不同植物组织NR活性有很大差异,叶中NR活性较高,根其次,茎最低;不同植物的NR活性随诱导时间呈不同的变化趋势,相同植物不同组织的NR活性变化趋势相似;不同植物叶片NRA为最高时KNO₃浓度不同。用30mmol/L的KNO3诱导番茄苗2h后,从番茄根和叶中提取总RNA,用RT-PCR方法获得NR cDNA,全长2736bp,编码911个氨基酸。为进一步利用该基因提高植物对硝酸盐的降解能力打下基础。     

水稻类受体蛋白激酶基因OsESG1的克隆与生物信息学分析

类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase,RLK)在植物生长发育等多种信号的响应中发挥重要作用。以水稻基因组为模板,通过PCR方法,扩增到一条全长2.2 kb左右的目的片段,序列分析结合RT-PCR表明,该片段由一个完整的开放阅读框组成,无内含子,命名为OsESG1(GenBank登录号:HE 584611),其编码蛋白产物包含749个氨基酸残基。结构分析显示,该蛋白产物包含1个跨膜区、胞外S位点糖蛋白(SLG)、PAN_AP结构域和S_TKc结构域,属于S-结构域型类受体蛋白激酶,推测其在植物生殖发育过程中起作用。