3,5-二氯苯基双胍抑制黑色素瘤肺转移的裸鼠体内药效学研究

目的 确认整合素αvβ3新型抑制剂3,5-二氯苯基双胍对人黑色素瘤肺转移的抑制作用.方法 应用前期建立的人黑色素瘤裸鼠肺转移模型,观察3,5-二氯苯基双胍的治疗效果.裸鼠尾静脉接种黑色素瘤细胞(第1天)后,于第5、9、13、17和21天给予该药物治疗.50 d实验结束,处死裸鼠并取完整的肺组织,Bouin氏液固定24 h后根据肺表面癌结节的大小和数量给予评分,以此评价肺转移的程度.结果 3,5-二氯苯基双胍6、12 mg/kg和24 mg/kg治疗组的转移分数分别为(55.25±13.60)、(35.13±17.36)和(12.83±11.44),与溶剂对照组(转移分数是82.50±17.72)相比具有明显差异(P＜0.05).阳性对照组的转移分数为(11.50±10.44)(P＜0.05 vs 溶剂对照组),阴性对照组和PBS对照组的转移分数分别为(88.50±17.21)、和(88.87±11.29) (P ＞0.05 vs溶剂对照组).结论 3,5-二氯苯基双胍在裸鼠体内能够明显抑制黑色素瘤肺转移,并呈现一定的剂量依赖性.     

脉络膜黑色素瘤中整合素αvβ3表达的研究

目的：整合素αvβ3整合素家族成员之一,是一类跨膜粘附分子,其在多种肿瘤细胞及新生内皮血管细胞中高表达而在成熟血管内皮、上皮细胞及正常细胞中表达较低或无表达。基于这些特征,整合素αvβ3年来成为分子影像研究的热点之一。鉴于整合素αvβ3人眼脉络膜黑色素瘤中是否存在表达尚不可知,本课题拟研究整合素αvβ3人脉络膜黑色素瘤中表达情况,为以整合素αvβ3基础的分子显像提供理论基础。方法：培养人源脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,使用蛋白免疫印迹方法检测整合素αvβ3OCM-1中表达水平,并使用免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中整合素αvβ3达分布。结果：蛋白免疫印迹实验表明在OCM-1细胞株中存在整合素αvβ3达,其表达水平介于已知高表达整合素αvβ3头颈鳞癌细胞株HEP-2和较低表达整合素αvβ3头颈鳞癌细胞株CNE-1之间,免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中也存在整合素αvβ3达。结论：人脉络膜黑色素瘤中具有整合素αvβ3达,可以为后期研究基于整合素αvβ3分子显像技术提供依据。     

脉络膜黑色素瘤中整合素α_vβ_3表达的研究

目的:整合素α_vβ_3为整合素家族成员之一,是一类跨膜粘附分子,其在多种肿瘤细胞及新生内皮血管细胞中高表达而在成熟血管内皮、上皮细胞及正常细胞中表达较低或无表达。基于这些特征,整合素α_vβ_3近年来成为分子影像研究的热点之一。鉴于整合素α_vβ_3在人眼脉络膜黑色素瘤中是否存在表达尚不可知,本课题拟研究整合素α_vβ_3在人脉络膜黑色素瘤中表达情况,为以整合素α_vβ_3为基础的分子显像提供理论基础。方法:培养人源脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1,使用蛋白免疫印迹方法检测整合素α_vβ_3在OCM-1中表达水平,并使用免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中整合素α_vβ_3表达分布。结果:蛋白免疫印迹实验表明在OCM-1细胞株中存在整合素α_vβ_3表达,其表达水平介于已知高表达整合素α_vβ_3的头颈鳞癌细胞株HEP-2和较低表达整合素α_vβ_3的头颈鳞癌细胞株CNE-1之间,免疫组化方法检测人脉络膜黑色素瘤病理切片中也存在整合素α_vβ_3表达。结论:人脉络膜黑色素瘤中具有整合素α_vβ_3表达,可以为后期研究基于整合素α_vβ_3的分子显像技术提供依据。     

抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达

目的:利用基因工程技术构建和表达抗人整合素αvβ3单链抗体(scFv)与人可溶性组织因子(sTF)的融合蛋白scFv-sTF。方法:用重叠延伸PCR技术扩增scFv基因,同时用组装PCR方法人工合成sTF基因,然后以酶切连接方式融合2个基因,并克隆至原核表达载体pQE80L中,构建表达质粒pQE80L-scFv-sTF,以重组子转化大肠杆菌M15诱导目的基因表达。结果:SDS-PAGE分析显示工程菌可以表达相对分子质量约55×103的融合蛋白scFv-sTF,Western印迹分析证实表达的目的蛋白具有6×His标签;经低剂量IPTG诱导和较低温度培养,scFv-sTF获得了可溶性表达;纯化回收目的蛋白,ELISA试验证实,该重组抗体分子具有良好的抗原结合活性。结论:构建并表达了抗人整合素αvβ3的单链抗体融合蛋白scFv-sTF,并验证了其抗原结合活性,初步证明它可以与抗原特异性结合,为进一步研究其抗肿瘤作用打下了基础。     

整合素αvβ3对MDA-MB-231BO乳腺癌细胞AKT信号通路的调控

旨在探究整合素αvβ3的单克隆抗体LM609在BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中对AKT(蛋白激酶B)信号通路的影响。利用免疫细胞化学法检测BSP不同表达水平的乳腺癌细胞中整合素αvβ3的表达量。BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231BO细胞,Western blotting在蛋白水平检测磷酸化AKT的表达,MTT试验和细胞划痕试验分别检测细胞增殖、迁移能力的变化。结果显示,与231BO-Scrambled细胞相比,231BO-BSP27细胞中BSP蛋白水平明显降低,抑制率达到(59.43±1.71)%;LM609分别处理两株细胞后,与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组21BO-BSP27细胞中AKT磷酸化水平下调明显,为(33.78±1.51)%(P<0.01);231BO-BSP27细胞和对照组231BO-Scrambled中细胞的增殖和迁移能力均有不同程度的下降(P<0.05)。LM609能够抑制胞内整合素αvβ3功能的表达,进而对AKT信号通路进行调控,并影响细胞增殖和迁移的发生。     

内皮抑素基因抗黑色素瘤细胞高转移的动物研究

目的:验证转内皮抑素基因抑制高转移性黑色素瘤细胞的转移能力.方法:将 pcDNA3.1-Endo 真核表达载体转染小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16F10,运用RT-PCR和Western-blot验证Endo的表达后,进行瘤细胞的粘附实验、体外侵袭和运动实验以及C57BL/6小鼠的皮下种植瘤和肺转移瘤试验,并进一步统计分析.结果:内皮抑素基因能明显抑制B16F10黑色素瘤细胞的粘附、体外侵袭和运动、体内成瘤以及肺转移能力,其中粘附抑制率36.4%,体外侵袭抑制率48.4%,细胞运动功能抑制率52.1%,肺转移抑制率为67.3%.结论:转内皮抑素基因能明显抑制黑色素瘤细胞的高转移能力.     

双靶点分子探针68Ga-RGD-BBN用于乳腺癌的microPET显像

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)和蛙皮素(bombesin,BBN)多肽分别能够特异性识别整合素αvβ3和胃泌素释放肽受体(gastrin releasing peptide receptor,GRPR).我们用谷氨酸将RGD和BBN连接制备成RGD-BBN异源二聚体多肽,用双功能连接剂NOT...     

斑马鱼黑色素瘤模型研究进展

斑马鱼作为一种新型模式动物已广泛应用于肿瘤疾病的相关研究,例如异种移植观察肿瘤转移、抗肿瘤药物高通量筛选和安全性评价,此模型能够使我们更好的认识肿瘤与机体活动的关系。恶性黑色素瘤是皮肤和其他器官的黑色素细胞产生的一种恶性肿瘤,致死率高且转移性强,且近年来,患病人数激增且呈年轻化趋势。斑马鱼与人类的黑素细胞发育和功能具有高度的保守型和一致性,同时恶性黑色素瘤发生和转移涉及到的信号通路在斑马鱼上高度保守,因此斑马鱼是研究黑色素瘤的发病机理和转移的新型常用模型。本文论述最新的斑马鱼模型运用于黑色素瘤疾病机制的研究的相关成果,及利用斑马鱼进行小分子化合物/药物筛选和研发的现状,最后总结了斑马鱼模型在黑色素瘤研究中的重要价值,将为黑色素瘤发病发生机制、寻找疾病治疗方法提供新的方法和思路。     

骨唾液酸蛋白通过整合素αvβ3调控ILK信号通路

旨在探究骨唾液酸蛋白(BSP)是否通过整合素αvβ3对整合素连接激酶(ILK)信号通路进行调控。BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞,流式细胞仪在细胞水平检测BSP不同水平的细胞株中整合素αvβ3的表达量。Western blotting检测磷酸化ILK水平的变化,MTT法检测细胞增殖能力。与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组231BO-BSP27细胞中整合素αvβ3的表达水平明显下调(61.32±1.94)%(P<0.01)。整合素αvβ3鼠抗单克隆抗体(LM609)处理前的BSP基因沉默组231BO-BSP27细胞与21BO-Scrambled细胞相比,ILK磷酸化水平下调明显(39.38±1.38)%(P<0.01);LM609处理后的231BO-BSP27细胞与21BO-Scrambled细胞相比,ILK磷酸化水平下调明显(33.78±1.51)%(P<0.01)。向乳腺癌细胞231BO-scrambled和231BO-BSP27中添加LM609,MTT试验结果显示两株乳腺癌细胞的增殖能力均有降低(P<0.05)。BSP通过整合素αvβ3对乳腺癌MDA-MB-231细胞ILK信号通路进行调控,并影响细胞增殖。     

裸鼠体内高转移人肺癌模型的筛选

将人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１Ｄ裸鼠皮下移植瘤作为瘤源,建立了ＰＬＡ－８０１Ｄ－ＡＳ裸鼠腹水鼠模型,其转移率及转移程度明显增高;以ＰＬＡ－８０１Ｄ－ＡＳ腹水瘤模型的肺转移灶细胞进行裸鼠皮下连续传代,建立了肺转移率及程度高于ＰＬＡ－８０１Ｄ的ＰＬＡ－８０１ＤＬ皮下移植瘤株。本文从肿瘤的异质性以及肿瘤与宿主相互作用的角度讨论了其肺转移提高的原因。     

人子宫内膜异位症裸鼠模型的建立

目的建立人子宫内膜异位症裸鼠模型。方法通过开腹手术方法将人子宫内膜组织块种植于裸鼠盆腹腔,观察其生长情况,并进行病理检查。结果成功建立人子宫内膜异位症裸鼠模型,种植病灶能保持原有内膜组织的形态结构,并可见血管生成明显。结论子宫内膜异位症裸鼠模型的建立是子宫内膜异位症早期临床研究的理想模型。     

两种人乳腺癌裸鼠移植模型的建立

目的建立简便的人乳腺癌裸鼠移植模型,并探讨其部分生物学特性。方法采用雌激素受体阴性的MDA-MB-231和SK-BR-3人乳腺癌细胞株,分别接种于10只裸鼠左侧腋窝皮下,移植细胞总数为1×107/只。观察肿块生长情况,第42天处死荷瘤鼠,切除肿块作病理切片。结果 MDA-MB-231接种后第5d在接种部位可见结节,成瘤率为90%（9/10）,接种42 d肿瘤体积426.6±333.8,瘤重0.417±0.276,病理学检查为浸润性导管癌;SK-BR-3接种后第11天在接种部位可见结节,成瘤率为80%（8/10）,接种42 d肿瘤体积357.5±246,瘤重0.325±0.167,病理学检查为浸润性导管癌。结论该方法建立的人乳腺癌裸鼠移植模型,皮下移植方法简单,易于操作,成功率较高,肿瘤可部分保持人乳腺癌生物学特性,为研究人乳腺癌提供了重要工具。     

Establishment of a Murine Model for Metastasis of Cytokine-Producing Tumor to the Brain

The A375 cell line, derived from human malignant melanoma, has characteristics of interleukin-6 (IL-6) production. By using this cell line, we have investigated a murine metastasis model of IL-6-producing tumors to the brain by injecting A375 cells directly into the left cardiac ventricle. Nude mice were anesthetized with intraperitoneal injection of pentobarbital sodium. Next, A375 cells suspended in phosphate-buffered saline (PBS) were injected into the left cardiac ventricle of mice. An intracardiac injection of 10⁵ cells developed tumor colonies in the brain after 4 to 6 weeks. Metastatic cells were found in every lobe of the brain. An immunocytochemical study revealed IL-6 production by A375 cells at the metastatic sites in the brain. By the transfection of genes encoding proteins into A375 cells, a novel model of protein expression in the brain in vivo could be constructed. Our system does not require great skill. Our experimental model will facilitate future studies of the local effects of proteins in the brain.     

Recombinant CBD-HepII polypeptide of fibronectin inhibits alphavbeta3 signaling and hematogenous metastasis of tumor

The interaction of integrin αvβ3 and its ligands are crucial for tumor metastasis. Recombinant CBD-HepII polypeptide of fibronectin, designated as CH50, suppressed the binding of tumor cells to ECM molecules, and abolished the promoting effect of soluble fibronectin and fibrinogen on tumor cell adhesion to ECM molecules. The underlying mechanisms involve the blockade and downregulation of αvβ3 and its co-receptor syndecan 1 by CH50. The activation of FAK, upregulation of cdc2, the production and activation of MMP-2 and MMP-9 by ECM molecules-stimulated tumor cells were inhibited by CH50. CH50 reduced the tumor cell arrest during blood flow, and also inhibited the invasive ability of tumor cells. The in vivo expressed CH50 suppressed the lung metastasis of circulating tumor cells, and prolonged the survival of mice after tumor cell inoculation. These findings suggest a prospective utility of CH50 in the gene therapy for prevention of tumor metastasis.     

胰腺癌裸鼠皮下异种移植动物模型建立研究

目的:用人体胰腺癌细胞株,建立小鼠胰腺癌细胞株(pGHAM-1)移植性胰腺癌模型,并研究其生物学特性。方法:将pGHAM-1细胞培养后配成1×107/ml,取0.2mL接种于小鼠皮下。于接种后20、30、40天观察肿瘤的生长、转移及腹水量。接种40天后处死动物,解剖取出移植瘤,用游标卡尺测量肿瘤大小,再进行HE染色的组织病理学检查,免疫组织化学检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)及肿瘤转移相关蛋白(nm23-H1)的表达。结果:分别于20、30、40天测量肿瘤体积为84.1±21.9 mm3,413.7±208.4 mm3,2187.3±1882.8 mm3,后者与10 d前比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。HE染色结果显示肿瘤组织呈条索状或小梁状排列,肿瘤组织与正常组织交界处有少量淋巴细胞浸润,肿瘤组织中血管生成罕见。免疫组织结果显示VEGF和nm23-H1蛋白在肿瘤组织中均呈阴性表达。结论:异位裸鼠人胰腺癌移植瘤模型易复制,时间短,成功率高,为胰腺癌体内研究提供了理想的动物模型。     

优化胶粘贴法建立裸鼠胃癌原位种植模型

目的通过对两种胶粘贴法建立的胃癌原位种植动物模型的比较研究,为探讨胃癌的发病机制和实验治疗提供理想的动物模型。方法用OB胶和FS生物蛋白胶法分别建立胃癌原位种植动物模型,观察和比较两种方法所建立的模型肿瘤生长状况、转移情况和形态学变化。结果FS生物蛋白胶组未出现肿瘤大片坏死,腹水形成率为85.7%,幽门梗阻发生率为57.1%;而OB胶组肿瘤大片坏死发生率为100%,腹水形成率为14.3%,未出现幽门梗阻。FS生物蛋白胶组有三例出现了肺和脑转移。结论FS生物蛋白胶法建立的裸鼠胃癌原位种植动物模型能更好的模拟人胃癌患者的临床过程,为研究人胃癌转移机制和实验治疗提供理想的动物模型。     

人喉癌裸鼠移植瘤模型的建立及部分生物学特性研究

用人喉癌手术切除标本建立了裸鼠移植瘤模型,已传至13代。原代移植成功率为66.7％,潜伏期30～70d;鼠间传代移植成功率为100％,潜伏期14～19d,生长稳定。经光学显微镜检查,各代移植瘤组织结构与原人喉癌组织基本一致。电镜检查证明,具有人喉癌特征,癌细胞间有大量桥粒,细胞浆中可见张力原纤维,有的张力原纤维与桥粒相连。细胞表面有较大的指状突,核膜较规则,胞浆中线粒体较多。     

Identification of an active site on the laminin alpha4 chain globular domain that binds to alphavbeta3 integrin and promotes angiogenesis

Angiogenesis is important for wound healing, tumor growth, and metastasis. The laminin alpha4 chain, a component of laminin-8 and -9, is expressed in endothelial cell basement membranes. It mediates endothelial cell adhesion by binding with its receptors such as alphavbeta3 integrin and participates in new blood vessel formation. In this study, we found the recombinant laminin alpha4LG modules (rLG1-3, rLG1, and rLG2) mediate HUVECs adhesion. The attachment of HUVECs to the rLG2 was specifically inhibited by a function-blocking monoclonal antibody LM609 specific for alphavbeta3 integrin. Using deletion mutants of the alpha4LG2 revealed the HUVECs-adhesion site is located in amino acids 1121-1139. A synthetic G(1121-1139) peptide could be attached by HUVECs at same efficiency with the rLG2 and promoted angiogenesis in CAM. In conclusion, we have identified a new alphavbeta3 integrin-interacting peptide within laminin alpha4 G domain. This suggests that G(1121-1139) peptide-containing proteins may perform their biological functions by interacting with alphavbeta3 integrin.     

人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型的建立

目的建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型。方法将1例人卵巢癌组织移植裸鼠,建立人卵巢癌裸鼠原代移植实体瘤模型的基础上,再将实体瘤皮下移植、实体瘤原位移植、实体瘤细胞移植裸鼠。观察裸鼠实体瘤生长和转移情况,称量其体重、子宫卵巢重、瘤重及瘤的大小,并作病理、电镜、染色体检查。结果成功地建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型,并已传至第18代,传代移植成功率100％,组织学和超微结构形态均证明该实体瘤保留了原人卵巢癌特征,有人卵巢癌染色体特征,并出现肝、脾转移。结论本研究建立人卵巢癌裸鼠移植实体瘤模型与人相似,通过18代传代和实验观察方法稳定可靠。为人卵巢癌的研究提供了理想的动物模型。