黄秋葵番茄红素β-环化酶LCYB基因的克隆与分析

应用RT-PCR和RACE技术克隆得到cDNA全长1797 bp的黄秋葵(Hibiscus esculentus L.)番茄红素β-环化酶基因LCYB,开放阅读框(ORF)包含1509个碱基;预测编码503个氨基酸,理论分子量(Mw)为56.288 kD,等电点(p I)为4.577;编码的蛋白与陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、黄麻(Corchorus capsularis L.)和可可(Theobroma cacao L.)同源蛋白的相似性均在88%以上,显示其高度的保守性,将基因命名为HeLCYB,GenBank登录号为:KX257998。Motif Scan分析显示,蛋白氨基酸序列88~481位为HeLCYB保守结构域,并在88~113位含有1个FAD结合域。通过荧光定量PCR分析表明,HeLCYB基因在黄秋葵根、茎、叶、花和果荚中均有表达;叶片生长中以成熟叶中表达最高,果实发育中以花后7d高表达。建立与优化了黄秋葵类胡萝卜素超高效液相检测体系,结果显示黄秋葵中主要含有β-胡萝卜素和叶黄素。β-胡萝卜素在成熟叶中含量最高,果实以花后7 d含量最高,与HeLCYB基因的表达呈正相关。本研究揭示了HeLCYB基因表达和类胡萝卜素积累的特性,为开展黄秋葵类胡萝卜素分子调控机制研究奠定了基础。     

鹤望兰番茄红素β-环化酶基因SrLCYB的克隆及表达分析

采用RACE方法从鹤望兰(Strelitzia reginae Banks)黄色花萼中克隆到1个LCYB基因(lycopene beta-cyclase,Sr LCYB)。其c DNA全长为1 908 bp(Gen Bank收录号:KT428725),具有完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),共1 515个碱基,编码504个氨基酸。鹤望兰Sr LCYB的氨基酸序列与其他物种都有一定的同源性,其中与百合的LCYB同源性最高,达到82%。系统进化树分析显示,鹤望兰Sr LCYB与芭蕉蛋白亲缘关系较近。应用荧光定量PCR分析表明,Sr LCYB在黄色花萼中高表达,且在花发育的始花期和盛花期表达量最高。应用UPLC(ultra performance liquid chromatography)对β-胡萝卜素含量进行分析,类β-胡萝卜素在黄色花萼中含量最高,且在花发育的盛花期含量最高。结果表明,Sr LCYB基因表达与β-胡萝卜素含量成正相关。     

黄秋葵八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

该研究根据黄秋葵(Hibiscus esculentus L.)转录组测序获得的八氢番茄红素脱氢酶基因(HePDS)序列(GenBank登录号为MG372370)设计引物,克隆验证得到1条HePDS基因全长为2 020 bp cDNA,开放阅读框(ORF)包含1 686个碱基;预测其编码561个氨基酸,理论分子量为62.62 kD,等电点为8.155;编码的蛋白与海岛棉(Gossypium barbadense)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、陆地棉(Gossypium hirsutum)同源蛋白的相似性均在93%以上,均含有1个保守的二核苷酸结合域和1个类胡萝卜素结合域,显示其高度的保守性。荧光定量PCR 分析表明,HePDS基因在黄秋葵根、茎、叶、花和果荚中均有表达;叶发育过程以嫩叶中表达最高,果实发育中以花后2 d表达量最高。类胡萝卜素含量随着叶、果实发育逐渐升高,成熟叶的含量最高,果实以花后4 d含量最高,且HePDS基因的表达与类胡萝卜素含量存在密切的相关性。该研究结果为进一步探讨HePDS基因的功能和调控机制,以及采用VIGS和CRISPR/Cas9技术开展黄秋葵基因功能的反向遗传学研究奠定了基础。     

外源ABA及其抑制剂钨酸钠对木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白的影响

旨在研究外源ABA及其抑制剂钨酸钠(Na_2WO_4)对木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白的影响。以木薯品种华南9号(Manihot esculenta Crantz SC9)为材料,HPLC测定块根β-胡萝卜素;Western blot分析相关蛋白表达量;QPCR分析相关基因表达量。结果显示,外源ABA及钨酸钠能提高块根β-胡萝卜素的含量;其中外源ABA与钨酸钠都提高了类胡萝卜素合成途径基因PSY2与LCYB表达,并抑制降解相关的ZEP与NCED3基因的表达,从而能够在转录水平的变化上解释β-胡萝卜素含量的变化,且LCYB与ZEP在转录与翻译水平具有一致性;与质体相关PAP1基因和FBN1a在处理下上调表达在一定程度上增加了质体小球的数量;外源ABA及钨酸钠使活性氧(ROS)相关的超氧化物歧化酶(Fe-SOD和Cu/Zn-SOD)表达量升高保护了块根中类胡萝卜素的稳定。这三者共同作用,提高了块根β-胡萝卜素的含量。     

枸杞L-半乳糖酸内酯脱氢酶基因的克隆及表达分析

以青海枸杞(Lycium barbarum L.)为模板,采用RT-PCR和RACE技术,克隆枸杞L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因序列,命名为LbGLDH。LbGLDH基因全长为2 114bp,包含一个开放读码框1 767bp(编码588个氨基酸)、5′末端序列57bp、3′末端序列290bp。LbGLDH基因核苷酸序列与番茄、马铃薯、烟草GLDH基因具有88%~90%的一致性。LbGLDH编码氨基酸序列包含GLDH蛋白酶具备的FAD-binding-4和ALO结构域。qRT-PCR分析结果显示,在枸杞不同组织中LbGLDH基因的表达、抗坏血酸含量和GLDH活性变化趋势相同,表现为在枸杞的花和果实中表达量最高,成熟叶中表达量最少。推测LbGLDH基因表达促进枸杞果实中抗环血酸含量的积累。     

木薯品种(系)类胡萝卜素代谢相关基因和蛋白表达水平分析

以白心木薯华南6068、华南9号、紫叶黄心木薯BGM019和粉红木薯Mirasol为材料,探究木薯块根膨大期和成熟期与类胡萝卜素代谢通路相关的14个基因和4种蛋白质表达水平变化。用HPLC检测块根β-胡萝卜素含量的变化,分别用qRT-PCR和Western blot方法对类胡萝卜素代谢通路相关基因和蛋白酶的表达水平进行分析。以华南6068为对照,研究结果表明:华南9号和紫叶黄心木薯BGM019成熟期中的类胡萝卜素合成途径关键基因PSY2、LCYB基因显著高于膨大期,而降解相关的关键基因CCD1、NCED3在成熟期的表达量显著低于膨大期(P0.05)。粉红木薯Mirasol成熟期中PSY2、LCYB的显著下调与CCD1、NCED3的显著上调(P0.05)是造成β-胡萝卜素含量差异的原因之一。通过分析不同木薯品种(系)在膨大期和成熟期块根类胡萝卜素代谢途径相关基因的表达水平,有助于解析β-胡萝卜素积累的分子机理。此外,Western blot结果显示抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和HSP70虽然和块根类胡萝卜素代谢途径没有直接关联,但它们在木薯膨大期和成熟期块根表达水平有显著差异(P0.05)。     

猕猴桃的功能成分在不同采收时间的变化

目前,关于功能性化合物在果实成熟阶段和采后成熟过程中的组成变化的研究很少。本研究检测了盛花后70～160 d (70～160 DAFB)收获并保持9周的猕猴桃关键功能分子含量的变化。研究显示,晚期采收的成熟果实含有较高水平的总酚和维生素C,而叶黄素和β-胡萝卜素含量较低。在早期(70～100 DAFB)收获的猕猴桃含有较高含量的叶黄素和β-胡萝卜素。然而,除了160 DAFB采收的果实6周储存后β-胡萝卜素含量急剧增加之外,在收获后贮藏期间,不管收获成熟度如何,类胡萝卜素含量没有明显变化。其他色素在成熟和贮藏过程中趋于减少。总之,猕猴桃在成熟的早期阶段进行采收可获得较高水平的类胡萝卜素含量,在成熟晚期收获的猕猴桃具有相对较高水平的维生素C和总酚含量。     

桃果实发育阶段肉色形成与类胡萝卜素的变化分析

为了分析不同肉色类型桃果实发育过程中类胡萝卜素成分的变化特点及其颜色差异形成的因素,选择‘半斤桃’(红肉)、‘图八德’(黄肉)、‘正姬’(白肉)桃品种为试材,采用紫外分光光度计和高效液相色谱法(HPLC)对桃果实类胡萝卜素及其组分含量进行定性定量分析.结果显示:(1)桃果实的主要类胡萝卜素成分为叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素.(2)随着果实的发育,‘半斤桃’和‘正姬’的类胡萝卜素总含量逐渐降低,而‘图八德’则是先降低后上升,且明显高于前二者;3种类型桃果实的叶黄素均逐渐降低,果实成熟时接近0;玉米黄素呈先降后升的趋势,果实成熟时达到最大值;‘半斤桃’和‘正姬’的β-隐黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素呈逐渐下降的趋势,而‘图八德’的β-隐黄质含量先升后微降最后上升、α-胡萝卜素和p-胡萝卜素含量则逐渐增加,且均在果实成熟时达到最大值.(3)‘图八德’成熟果实中的类胡萝卜素总含量达到最大值,其中β-胡萝卜素含量最高,占5个成分之和的75.99％.研究表明,桃果实肉色形成与类胡萝卜素的含量与成分有着紧密的联系,尤其是其中的β-胡萝卜素含量.     

拟态弧菌溶血素基因的克隆测序与生物信息学分析

目的对拟态弧菌安徽分离株HX4(V.mimicusHX4株)的全长溶血素基因(vmh)进行克隆测序和生物信息学分析,为表达溶血素蛋白(VMH)奠定基础。方法采用PCR法扩增V.mimicusHX4菌株全长vmh基因,将其克隆至pMD18-Tvector并进行测序,应用生物信息学软件分析vmh基因的同源性及其编码蛋白的分子特征。结果V.mimicusHX4菌株vmh基因全长序列2235 bp,编码由744个氨基酸组成的分子量约为82.85 kDa的VMH蛋白。V.mimicusHX4菌株vmh基因的核苷酸序列和氨基酸序列与参考株相应序列的同源性分别介于98.9%~99.1%和96.6%~97.3%。VMH蛋白N端前25个氨基酸组成信号肽,7~27位氨基酸之间存在一个跨膜区域,蛋白二级结构中无规卷曲含量最高,达39.52%,其次为α-螺旋和β-折叠,分别占25.81%和26.75%,β转角含量最低,仅占7.93%。VMH蛋白含有多个T细胞和B细胞抗原表位,同时存在T、B细胞抗原表位的区域最有可能位于肽链第86~95、193~211、419~440和459~501位区段。结论拟态弧菌VMH蛋白是一种高度保守的毒素蛋白,对HX4菌株vmh基因及其编码蛋白信息特征的了解,有助于进一步表达VMH蛋白。     

杜氏盐藻DsKASⅢ基因的分离鉴定及其在氮胁迫下的表达分析

分离鉴定杜氏盐藻(Dunaliella salina)β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ(β-ketoacyl-ACP synthase Ⅲ,DsKASⅢ)基因并解析其编码蛋白理化特征及功能。依据同源克隆,分离杜氏盐藻DsKASⅢ基因编码序列,采用生物信息学方法解析DsKASⅢ编码蛋白的理化特性及功能,qRT-PCR检测缺氮条件下DsKASⅢ的表达谱,并检测细胞总油脂和β-胡萝卜素含量的变化。结果表明,杜氏盐藻KASⅢ基因含有9个外显子,ORF为960 bp,编码蛋白为319 aa。DsKASⅢ蛋白理论等电点pI为6.21,分子量为33.3 kD。亚细胞定位预测DsKASⅢ蛋白呈镶嵌状锚定在叶绿体内膜上,这种构象有助于利用能量高效率催化生化反应。DsKASⅢ蛋白二级结构主要由α-螺旋(35.11%)、β片层(25.71%)和无规则卷曲(27.90%)组成。三维模拟显示,DsKASⅢ蛋白以同源二聚体形式发挥催化功能的。系统发育分析表明,DsKASⅢ蛋白与莱茵衣藻KASⅢ蛋白亲缘关系最近,暗示其可能有共同的进化来源。qRT-PCR分析揭示,氮胁迫培养条件下,DsKASⅢ基因的表达显著升高,且在缺氮第3天时,表达量达峰值,比正常氮充足培养高1.1倍。氮胁迫培养的藻细胞总脂含量和β-胡萝卜素含量分别比正常氮充足培养的藻细胞提高49.05%和33.20%。氮胁迫能诱导DsKASⅢ基因的上调表达,进而促进杜氏盐藻细胞合成和积累高量油脂和β-胡萝卜素。研究为全面阐明氮胁迫条件下杜氏盐藻油脂及β-胡萝卜素合成及调控机制提供了科学依据。