影响草地早熟禾（Poa pratensis L.）基因枪转化关键因素研究

将含有DREB1A基因的表达载体,通过基因枪法转化草地早熟禾的胚性愈伤组织,探讨了金粉沉淀剂、金粉直径等因素对转化的影响,同时通过不同浓度潮霉素（Hygromycin,简称Hy）对未转化愈伤组织的筛选,获得最佳筛选浓度。结果表明,适合于草地早熟禾基因枪轰击的条件为：Ca（NO3）2＋PEG4000包被质粒DNA;1μm金粉作为质粒DNA的载体;合适的轰击高度为6cm、轰击次数为1次、无渗透处理。采用Hy作为草地早熟禾转基因植株抗生素筛选标记时,Baron品种愈伤组织继代的临界筛选浓度为100mg/L。     

Prd29A及DREB1A的克隆和干旱诱导型植物表达载体的构建与鉴定

从拟南芥中克隆了RD29A基因的启动子(Prd29A)及DREB1M基因的DNA片段,构建Prd29A:DREB1A融合基因,采用合成的接头将该融合基因插入到植物表达载体pBI121中,经鉴定,确认正确.     

逆境诱导型启动子rd29A的克隆及植物表达载体的构建

根据文献上发表的逆境诱导型启动子rd29A 序列设计并合成了一对引物, 通过PCR 的方法从拟南芥基因组中扩增到rd29A 的启动子序列。根据GenBank 中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA 序列设计并合成了一对引物, 通过RT-PCR 的方法从低温处理的拟南芥总RNA 中扩增出DREB1A 基因的全长cDNA 片段。以植物表达载体pBch 为基础, 构建了由rd29A 调控的DREB1A 基因的植物表达载体pBDR29A, 为利用DREB1A 基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

转录因子DREB1A和DREB2A调控机制的比较分析

DREB转录因子即干旱应答元件结合蛋白质,它能特异结合启动子中含有DRE／C1KT顺式元件,激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对逆境的忍耐力。从DREB1A和DREB2A转录因子结构、功能、调控表达的基因以及蛋白稳定性等方面进行比较分析,为植物抗逆转录因子研究及应用提供依据。     

转录因子DREBlA和DREB2A调控机制的比较分析

DREB转录因子即干旱应答元件结合蛋白质,它能特异结合启动子中含有DRE/CRT顺式元件,激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对逆境的忍耐力.从DREB1A和DREB2A转录因子结构、功能、调控表达的基因以及蛋白稳定性等方面进行比较分析,为植物抗逆转录因子研究及应用提供依据.     

转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用Gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。     

DREB1A 转录因子蛋白的原核表达

DREB1A是DREB转录因子的一员,它们都含有一段与DNA结合的保守区域,由58个氨基酸组成,称为EREBP/AP2结构域(EREBP/AP2 domain)。一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达。从拟南芥中克隆了DREB1A转录因子基因,成功构建了DREB1A基因的原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导表达获得了DREB1A蛋白,但以包涵体形式存在。为以后深入研究DREB转录因子与DRE顺式作用元件相互作用的具体机制奠定了基础。     

转录因子DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA序列设计并合成了一对引物,通过RT-PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出DREB1A基因的全长cDNA片段。将其克隆到pMD18 T-vector中。经测序证明该片段与GenBank上报道的序列具有99.8%的同源性。2个碱基的置换导致了一处氨基酸的差异,但这一氨基酸并不在基因的功能结构域上,推测其不会影响基因功能。以植物表达载体pBch为基础,构建了由组成型启动子35S调控的DREB1A基因的植物表达载体pBDR35S,为利用DREB1A基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。     

CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达

本研究的目的是将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中,利用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中,PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。     

白腊DREB基因克隆中简并引物的设计

根据拟南芥DREB2A基因序列进行GenBank内Blastx序列同源性查询,对其中同源性较高的25个氨基酸序列进行了分析,设计简并引物,应用RT-PCR技术克隆白腊DREB2A基因,得测长2473bp,与拟南芥DREB2A同源性为96.94%的基因片段,并在GenBank登记,注册号为AY536056。     

基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究

以小麦品种H6756和藁城8901作为基因枪转化的靶材料,取其护颖至雌雄蕊原基形成期的幼穗,用含逆境诱导转录因子DREB1A和bar基因的质粒pAHC25轰击胚性愈伤组织,在分别含有5mgL和10mgLBasta溶液的培养基上进行筛选。得到的抗性愈伤组织在不含Basta溶液的培养基上再生培养,获得218棵再生植株。田间涂抹浓度为100mgL的Basta溶液检测后,对抗性植株作PCR检测,获得54棵再生植株。通过对其中20株T1代的PCR和Southern杂交分析,已获得14株含DREB1A和bar基因的转基因小麦植株,其中H675613株,藁城89011株。     

早熟禾品种间遗传多样性分析

草地早熟禾（Poa pratensis L.）是一种重要的冷季型草坪草,抗逆性强,适应性广,株型低矮,绿色期长,并且在良好的管理条件下,特别适合用作运动场草坪。近几年来在我国的园林绿化和建植运动场中得到了广泛的应用,现在已经引进的品种多达上百种。选用28个随机引物对15个草地早熟禾品种和1个加拿大早熟禾品种进行RAPD分析,25个引物共扩增出218条带,多态条带比率为89.91％。并且对每个品种的几项坪用特性进行了观察。聚类分析结果表明草地早熟禾品种之间的遗传多样性较低, 相似性集中在60.76％～98.52％。加拿大早熟禾的一个品种单成一支,与其他草地早熟禾的品种相似性较低。品种之间的聚类关系与表型特征呈现不完全相关性。     

<Emphasis Type="Italic">Agrobacterium</Emphasis>-mediated transformation of shoot apices of Kentucky bluegrass (<Emphasis Type="Italic">Poa pratensis</Emphasis> L.) and production of transgenic plants carrying a <Emphasis Type="Italic">betA</Emphasis> gene

Apical meristems of multiple shoots produced from axenic seedlings of Kentucky bluegrass (Poa pratensis L.) were used for Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Transformation parameters were optimized for concentration of bacterial cells, duration of infection, and vacuum infiltration. The highest transformation frequency (1.42%) was obtained by infection with Agrobacterium suspension of OD₆₀₀ = 0.6 for 5 min, under a negative pressure of 0.5 × 10⁵ Pa. After co-cultivation, the herbicide-resistant plants were rooted and transplanted into flowerpots. Transgenic plants were confirmed by polymerase chain reaction (PCR) assay and Southern blot analysis. Using this transformation system, the betA gene encoding choline dehydrogenase and mutant als gene encoding the enzyme acetolactate synthase were introduced into three Kentucky bluegrass cultivars.     

Black cutworm (Lepidoptera: Noctuidae) larval emigration and biomass in mixtures of endophytic perennial ryegrass and Kentucky bluegrass.

Studies examined the possibility that mixtures of endophytic perennial ryegrass and Kentucky bluegrass provide resistance against larvae of the black cutworm, Agrotis ipsilon (Hufnagel). We hypothesized that resistance against A. ipsilon in such stands would stem from the influence of Kentucky bluegrass on A. ipsilon growth and behavior rather than the influence of endophytic perennial rvegrass. In replicated greenhouse experiments, black cutworm larvae initially emigrated more quickly from pots containing monocultures of endophytic perennial ryegrass than from Kentucky bluegrass monocultures or polycultures of Kentucky bluegrass and endophytic perennial ryegrass. However, biomass of emigrating larvae decreased linearly as the proportion of Kentucky bluegrass increased. Turfgrass mixtures containing endophytic perennial ryegrass and Kentucky bluegrass may provide resistance against A. ipsilon mainly through the physiological effects of Kentucky bluegrass on A. ipsilon growth and development, but possibly through the influence of endophytic perennial ryegrass on A. ipsilon movement and foraging behavior as well.     

农杆菌介导的单子叶植物早熟禾的转化

利用种子和胚分别在两种培养基K3和K5诱导产生了早熟禾(Poa pratensis L.)一个品种Mado的胚性愈伤组织.K3培养基含有10.0μmol/L的二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.5μmol/L的苄氨基嘌呤(BAP).K5培养基是K3另加0.5μmol/L的硫酸铜.光照条件为20～30 μmol.m-2.s、16 h光照、8 h黑暗.温度保持在24℃.用携有bar基因和gus基因的pDM805质粒转化的农杆菌AGL1对胚性愈伤组织进行转化.共得到4个转基因株系.影响转基因效率的主要因素有愈伤组织的胚性、光照条件、共转化时间、抗生素浓度、选择压力.本研究建立了单子叶早熟禾农杆菌介导的转基因方案.     

大麦转化体系的改进及TrxS基因的转化

以啤酒大麦品种“晋引6号”的幼胚为转化起始材料,用基因枪法将分别携带有目的基因(TrxS)和除草剂基因(筛选基因,Bar)的两个质粒进行了共转化,同时对基因转化的相关技术和植株再生的培养方案进行了优化。结果表明,受体材料宜选用预培养15d的幼胚;在培养前2周添加1mg／L ABA可抑制胚芽萌发而且有助于胚性愈伤组织的形成;1．0mg／L ZT与0．1mg／L IAA激素配比可有效促进愈伤组织的分化。利用优化的培养条件,经在含3～5mg／L筛选剂PPT的培养基上筛选、再生及生根培养。共在178块抗性愈伤组织上获得11株再生植株,再生率达到6．2％,经对T0、T1、T2代PCR、nested PCR和Southern杂交检测表明,TrxS基因已经稳定整合到大麦基因组中且遗传稳定、结构完整。     

萝卜低温胁迫转录因子的克隆及遗传转化

采用RT-PCR和电子克隆技术从抗寒植物萝卜(Raphanus sativusL.)中分离了一个低温胁迫转录因子的cDNA全长序列,命名为RsICE1(GenBank登录号为HQ891287).序列分析显示,该基因全长1 375 bp,编码区为1266 bp,编码421个氨基酸.序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其他植物的ICE1蛋白具有较高的同源性.进化树分析表明,RsICE1编码的蛋白与油菜的ICE1编码蛋白亲缘关系最近,处在同一进化分枝.半定量RT-PCR分析表明,RsICE1是冷诱导条件下差异表达的基因.构建该基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法转化粳稻品种龙粳24,经PCR和RT-PCR分子检测,证明RsICE1基因已经整合到水稻基因组中,并正常表达.与对照相比,低温处理后转基因株系存活率和脯氨酸含量明显增加,相对电导率积累速率明显下降,提高了抗低温胁迫能力.