高质量抗体揭示Rad1蛋白在细胞中新的潜在活动机理

一组在进化上(从酵母到人)保守的基因Rad9、Rad1和Hus1在细胞周期监控点调控和DNA损伤修复中发挥重要作用．这三个蛋白可以形成环形异源三聚体,即9-1-1蛋白复合体．9-1-1复合体被认为是Rad9、Rad1和Hus1行使功能的主要形式．到目前为止,没有一个好的抗Rad1的抗体,严重阻碍了对Rad1和9-1-1复合体的研究．在本研究中,我们成功地制备了一株小鼠抗Rad1蛋白的单克隆抗体．这个抗体能够有效地检测小鼠和人的内源Rad1蛋白,可以用于酶联免疫吸附、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光等实验．利用该抗体,我们发现在DNA损伤剂羟基脲(HU)的诱导下,小鼠Rad1蛋白在Rad9^+/+小鼠胚胎干细胞中表达明显增加,而在Rad9^-/-的小鼠胚胎干细胞中没有观察到该现象,这表明Rad9对Rad1的蛋白表达有调控作用．此外,内源的Rad1蛋白主要分布在细胞质中,在HU处理后并没有迁移进入细胞核的现象,这与先前广泛被人们所接受的在DNA损伤压力下Rad1和Hus1能够迁移进入细胞核并与Rad9形成9-1-1蛋白复合体的说法相矛盾．综合看来,Rad1和9-1-1蛋白复合体的分子作用机制比预期的要复杂,我们成功制备的Rad1单克隆抗体将成为研究Rad1以及9-1-1蛋白复合体的强有力的工具．     

硒抗辐射损伤作用的探讨

小鼠分次腹腔注射1.5mg Se/kg后,用 ⁶⁰Co 6.0Gy一次照射,观察硒对血及肝脏亚细胞组分线粒体GSHPx活性,LPO含量改变和 ³H-TdR掺入的影响,以及在不同时间血和肝的GSHPx活性变化。并对不同剂量硒对LPO形成的影响进行了研究。结果表明,给硒及 ⁶⁰Co照射后小鼠体内的GsHPx活性显著增高;硒表现一定的抗辐射损伤作用和对损伤机体的恢复作用。另一方面,当给硒量在0.5mg/kg以上时,随着硒浓度的增加,LPO也增加,存在剂量效应关系。     

牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ cDNA分子克隆及其蛋白质结构分析

利用基因特异引物Y_MTSP₁和Y_MTSP₂,通过RT-PCR从牦牛肝脏组织RNA中克隆出了牦牛MT-Ⅰ(GenbankAccessionNo:AY513744)和MT-Ⅱ(GenbankAccessionNo:AY513745)基因编码区全长。将牦牛MT-Ⅰ和MT-ⅡcDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现,牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ编码区序列在不同哺乳动物中相当保守。牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ编码的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白分别由61个氨基酸组成,其具有保守的短肽结构如:C-X-C,C-C-X-C-C,C-X-X-C等,其决定MT蛋白分子的整个三维结构,在分子进化上十分保守。同时对牦牛MT的疏水性和跨膜区分析表明,牦牛MT蛋白可能不存在跨膜区,也不存在信号肽,是1种非分泌蛋白。并通过同源比较模建,预测和构建了牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白的分子空间结构,表明牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ由α-和β-两个结构域组成,在α-结构域含有5个Cys短肽结构,β-结构域有4个Cys短肽结构,且2个结构域由保守的三肽序列KKS相连。     

间充质干细胞移植对放射性肠损伤修复作用的实验研究

探讨了人间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对NOD/SCID小鼠放射性肠损伤的修复作用．将雄性NOD/SCID小鼠随机分为3组,每组6只,即A组为空白对照组,B组为模型组,C组为治疗组．B组和C组小鼠全腹接受5 Gy ⁶⁰Co γ射线单次照射,剂量率为100 cGy/min．照射后B组小鼠经尾静脉注射生理盐水,C组小鼠移植MSCs．于移植后第15天取小鼠空肠标本,通过免疫荧光方法检测MSCs在受损肠道的定植和分化情况．结果表明,治疗组小鼠的生存状况明显好于模型组小鼠,病理切片显示小肠黏膜得到修复,免疫荧光结果显示MSCs可定植于辐射损伤的肠道,并表达波形蛋白(vimentin)和α-SMA．MSCs移植入肠损伤的小鼠体内后可在受损肠道定植,并向间质细胞分化,参与辐射损伤的修复.     

Ⅰ-Ak基因克隆转导及对肿瘤细胞成瘤的影响

采用RT-PCR方法合成小鼠MHCⅡ类分子Ⅰ-A^k基因α和β链cDNA,插入逆转录病毒载体pLSXN,构建Ⅰ-A^k α和Ⅰ-A^k β表达载体,采用脂质体介导的重组质粒转移方法将Ⅰ-A^k α和Ⅰ-A^k β基因导入EL4小鼠淋巴瘤细胞和P815小鼠肥大细胞瘤细胞,经流式细胞仪检测在细胞表面有Ⅰ-A^k表达.将以上两种细胞注射到同源小鼠C57BL/6(H-2^d)皮下,观察到肿瘤产生后又消退,证明在肿瘤细胞中单独导入同种异型MHCⅡ类分子基因也能激活肿瘤的细胞免疫,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

大肠杆菌tRNALeu的基因克隆、高效表达和纯化

用化学法合成的tRNA^Leu 和tRNA^Leu ₂的基因分别连接到 pTrc99B质粒载体上 ,转化到大肠杆菌MT10 2中 .DNA测序筛选得到与已知tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 的基因顺序完全相同的克隆 .对带有tRNA^Leu₁ 和tRNA^Leu₂ 基因的 2个转化子 (MT -Leu1和MT- Leu2 )表达条件进行了优化 ,MT- Leu1和MT- Leu2总tRNA中的亮氨酸接受活力分别达到 810 pmol/A2 6 0 和 5 60 pmol/A2 6 0 :tRNA^Leu₁ 占MT -Leu1总tRNA的5 0 % ;tRNA^Leu₂ 占MT- Leu2总tRNA的 3 0 % .经DEAE Sepharose、BD -纤维素层析柱 ,可分别将MT- Leu1和MT -Leu2的总tRNA纯化到 160 0pmol/A2 6 0 .首次准确地测得了 2种等受体tRNALeu的氨酰化反应动力学常数 .     

齐墩果酸通过调控STAT3通路改善咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损表现

摘要 目的：观察齐墩果酸对咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠的皮损及STAT3通路的干预作用。方法：72只BALB/c雄性小鼠,按随机数字表法随机分为空白组、模型组、甲氨蝶呤组、齐墩果酸低、中、高剂量组,每组12只,于背部备皮。除空白组外,其余各组小鼠每日于背部备皮区域涂抹5%咪喹莫特乳膏诱导银屑病样皮损;甲氨蝶呤组及齐墩果酸各浓度组每日灌胃对应药物0.2 mL/只;每日观察皮损状态并拍照记录,每日对小鼠皮损面积及严重程度（Psoriasis Area and Severity Index,PASI）进行评分;造模第4、7天取小鼠皮损区域皮肤,免疫印迹法检测皮损中STAT3信号通路中STAT3磷酸化表达情况;第7天称量小鼠体重及脾重,计算脾指数,同时取小鼠皮损区域皮肤;苏木素-伊红（HE）染色观察皮损组织病理学改变,并测量表皮厚度;免疫组织化学法及免疫组织荧光法检测皮损中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞浸润情况及Ki67表达情况;实时荧光定量PCR法检测皮损中白介素-17（Interleukin-17,IL-17）mRNA相对表达情况。结果：与空白组相比,造模后模型组小鼠背部皮肤出现红斑、鳞屑、浸润性皮损,第4天及第7天PASI评分升高（P<0.01）;第7天模型组表皮厚度明显增加,体重下降,脾指数上升,皮损中Ki67、CD3⁺、CD4+⁺、CD8⁺T细胞表达量升高,皮损中IL-17的mRNA相对表达量升高（均P<0.01）;第4及第7天,模型组小鼠皮损中p-STAT3的表达量均明显升高（P<0.05,P<0.01）;与模型组相比,第4天各治疗组在PASI评分略降低（P>0.05）,第7天各治疗组PASI评分明显降低（均P<0.01）;第7天齐墩果酸各剂量组小鼠体重略有上升（P>0.05）;甲氨蝶呤组小鼠脾指数明显下降（P<0.01）,齐墩果酸低、中剂量组小鼠脾指数略下降（P>0.05）;各治疗组小鼠表皮厚度较模型组明显下降（P<0.01或P<0.05）,小鼠皮肤中Ki-67表达量、CD4⁺、CD8⁺T细胞表达量均明显降低（均P<0.01）;甲氨蝶呤组、齐墩果酸低、中、高剂量组小鼠皮损中CD3⁺T细胞表达量均下降（P<0.05,P>0.05,P<0.01,P<0.01）,其中在齐墩果酸各剂量组中,中剂量组在脾指数下降、表皮厚度变薄、CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞减少方面均略优于低、高剂量组（P>0.05）;甲氨蝶呤组及齐墩果酸中剂量组小鼠皮损中IL-17的mRNA水平较模型组明显下降（P<0.01,P<0.05）;造模给药第4天,甲氨蝶呤组小鼠皮损中p-STAT3水平较模型组明显下降（P<0.05）,齐墩果酸中剂量组略下降（P>0.05）;造模给药第7天,两个治疗组小鼠皮损中p-STAT3水平较模型组均明显下降（均P<0.01）。结论：齐墩果酸低、中、高剂量均可以改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损的严重程度,减轻炎性细胞浸润,中剂量组疗效较好,其机制可能通过抑制STAT3通路中p-STAT3的表达从而降低了IL-17的含量,且药效随作用时间的延长而逐渐增加。     

小鼠肝脏金属硫蛋白Metallothioneins的分离纯化与鉴定

由健康小鼠通过皮下注射一定量的氯化镉,取肝脏匀浆,离心,经SephadexG-50和DEAE-Sephadex A-50柱层析分离,即可获得MT-Ⅰ和MT-Ⅱ两种金属硫蛋白。经鉴定:两个分子各含18个巯基,结合4个Cd原子和3个Zn原子,无金属蛋白质Thionein的分子量约为6kD,半胱氨酸含量约占氨基酸总量的28％,所提取到的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ经氨基酸组成,HPLC和PAGE分析皆证明为高度均一的,且与有关文献报道基本相符。其中MT-Ⅱ已获得晶体。     

水体悬浮泥沙对黑藻生长和叶绿素荧光特性的影响

利用粒径小于100 μm的泥沙调制水体浊度分别维持在30、60和90 NTU,将黑藻幼苗种植于上述水体中,定期测定植株的分枝长、分枝数和鲜质量,利用水下饱和脉冲荧光仪（DIVING-PAM）测定叶片在光化光下的荧光参数.结果表明：随着泥沙含量的增加,植株分枝数受到明显抑制,生物量逐渐降低,而分枝长则呈显著增加趋势;随着试验时间的延长,浑浊水体中光化学最大量子产量（F_v/F_m）值呈明显〖JP2〗降低趋势,但显著高于对照.在17 μmol·m^-2·s^-1光化光照射下,与第30天相比,第60天时30、60和90 NTU组植株叶片的有效荧光产量（△F_v′/F_m ′）分别增加了48.9%、36.8%和17.2%（P<0.01）,相对光合电子传递速率（rETR）分别增加了56.7%、42.2%和21.4%（P<0.01）;而在104 μmol·m^-2·s^-1光化光照射下,第60天时植株的△F_v′/F_m′、光化学淬灭系数（q_P）和rETR显著降低,且热耗散能力（q_N）也显著降低,表明黑藻植株适应低光环境, 且在高光强条件下黑藻叶片易受到光伤害.可引种黑藻幼苗于混浊的浅水水体中.     

培养法与直接法外周血淋巴细胞微核率的比较研究

用⁶⁰Co r线1.0-5.0Gy照射狗，比较照后12小时培养法和直接法外周血淋巴细胞微核率，结果微核率随剂量增加而增加，培养法增加的速度和幅度明显高于直接法，经统计学分析二者存在一定的相关性。     

牦牛MT-I/-Ⅱ cDNA分子克隆及其蛋白质结构分析

利用基因特异引物YMTSP1和YMTSP2,通过RT-PCR从牦牛肝脏组织RNA中克隆出了牦牛MT-Ⅰ(Genbank Accession NoAY513744)和MT-Ⅱ(Genbank Accession NoAY513745)基因编码区全长.将牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ cDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现,牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ编码区序列在不同哺乳动物中相当保守.牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ编码的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白分别由61个氨基酸组成,其具有保守的短肽结构如C-X-C,C-C-X-C-C,C-X-X-C等,其决定MT蛋白分子的整个三维结构,在分子进化上十分保守.同时对牦牛MT的疏水性和跨膜区分析表明,牦牛MT蛋白可能不存在跨膜区,也不存在信号肽,是1种非分泌蛋白.并通过同源比较模建,预测和构建了牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白的分子空间结构,表明牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ由α-和β-两个结构域组成,在α-结构域含有5个Cys短肽结构,β-结构域有4个Cys短肽结构,且2个结构域由保守的三肽序列KKS相连.     

利用RNO脱色反应检测类囊体中的单线态氧

光敏剂RB在光照射下与O₂反应产生 ¹O₂, ¹O₂与组氨酸或咪唑反应的中间产物使RNO发生氧化,导致RNO在440 nm处吸光度减小,此即为RNO脱色反应.RNO脱色反应随着光照时间的增加而增大,表明RB受光照射后使 ¹O₂增加;随着组氨酸或咪唑浓度的增加,RNO脱色反应增大;咪唑在RNO脱色反应中的作用更明显. ¹O₂淬灭剂NaN₃或DABCO存在时,RNO脱色反应降低.利用RNO脱色反应检测到莴苣类囊体在强光照射下产生的 ¹O₂,随着光强和照射时间增加,类囊体中 ¹O₂的产生增加.     

体外培养脐血单个核细胞与CD34+富集细胞

对比MNC和CD34⁺富集细胞在SCF+IL-3+IL-6+FL+Tpo细胞因子组合下的体外扩增特性,发现：CD34⁺富集细胞具有很高的扩增潜力,在本实验条件下其总细胞持续扩增了8周,扩增倍数达31270.9±8640.5倍;而MNC在培养至第4周扩增就已呈现下降趋势,最大仅扩增了53.3±6.2倍。对比集落和CD34⁺细胞的扩增发现,MNC的集落密度和CD34⁺细胞含量由第0天至第7天有一个上升的过程,而CD34⁺富集细胞在培养过程中,集落密度和CD34⁺细胞含量却始终呈下降趋势。在体外培养过程中,CD34⁺富集细胞的CFU-GM和CD34⁺细胞最大分别扩增了185.7±14.1和191.7±188.8倍,明显高于MNC的12.4±3.2和50.6±33.2倍;而CD34⁺富集细胞和MNC的BFU-E则只实现了少量扩增,分别为7.2±5.2和10.1±3.4倍。结果显示,从CD34⁺富集细胞出发扩增造血干/祖细胞,可以得到更多的CD34⁺细胞和CFU-GM集落形成细胞。      

p18INK4C基因缺失增强造血干细胞在亚致死剂量

观察p18^INK4C (p18)基因缺失对造血干细胞(HSC)在亚致死剂量照射小鼠体内长期植入的影响. 供体为p18基因缺失型(p18^-/-)纯系C57BL/6小鼠(CD45.2表型), 竞争性细胞来源于C57BL/6-Ly5.1(CD45.1/2)双表型小鼠, 受体为野生型(p18^+/+)C57BL/6-Ly5.1(CD45.1)小鼠. 竞争性骨髓移植(cBMT)实验根据受体小鼠照射剂量的不同分为3个剂量组(10 Gy, 5 Gy和1 Gy). 供体细胞和竞争性细胞1:1混合后移植, 移植后采集外周血和骨髓细胞用流式细胞仪检测各细胞比例. 造血恢复移植实验: 移植后检测外周血白细胞计数评价移植后造血恢复速度. 10和5 Gy照射剂量组, 供体细胞和竞争性细胞成功植入, 而1 Gy照射剂量组无供体细胞植入. 无论在10 Gy或是5 Gy照射剂量情况下, 供体细胞在受体内的比例均高于竞争性细胞. 移植后6周, 10和5 Gy照射剂量时外周血中供体细胞比例分别为竞争性细胞的1.46±0.21倍和1.64±0.43倍, 14周时分别为竞争性细胞的1.84±0.25倍和2.00±0.49倍, 26周时分别为竞争性细胞的3.13±0.79倍和3.24±1.33倍. 移植后6个月, 10 Gy照射剂量时骨髓细胞中供体细胞比例为竞争性细胞的7.68±4.42倍, 5 Gy照射剂量时为竞争性细胞的10.83±2.98倍. 移植后6个月, 在10和5 Gy照射剂量组之间骨髓中造血细胞植入率相当, 分别为(85.53±8.71)%和(80.87±2.87)% (P = 0.457). p18^-/-细胞与p18^+/+细胞相比, 移植后造血恢复的速度相当. p18基因缺失可以显著增强HSC在亚致死剂量照射小鼠体内的长期植入能力.     

滇紫草培养细胞中色素合成的代谢调节

培养基中分别加入浓度为10^-5mol／L的铜离子,滇紫草愈伤组织中色素含量提高了5．5倍,悬浮细胞中色素含量提高8．1倍。细胞培养第21天,加入浓度为10^-5mol／L的L-Phe,色素的合成量最大。浓度为10^-6mol／L的抗坏血酸,能明显地促进培养细胞中色素的合成。     

棕尾别麻蝇金属硫蛋白的分离纯化及性质分析

将棕尾别麻蝇Boettcherisca peregrina幼虫置于含800 μg/g CdCl₂的食物中取食48 h后,可诱导金属硫蛋白(MT)的合成。诱导处理后的幼虫匀浆上清液经Sephadex G-50分子筛柱、UNO^TM Q1阴离子交换柱和Bio-Gel P-6脱盐柱层析,纯化得到2个亚型,即MT-Ⅰ和MT-Ⅱ。MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的分子量均为9 kD,每蛋白分子均含7个Cd和20个巯基,且具254 nm的Cd-SH特征吸收肩。两者的氨基酸组成中,以半胱氨酸含量最高,分别为36.6%和31.8%;而芳香族氨基酸和组氨酸含量甚少,约1%～2%。     

酵母完整细胞快速高效转化法

通过研究影响转化效率的诸因素,最终找到一种快速、高效酵母完整细胞转化法。整个转化步骤能在1．5h内完成。在实验中发现：小牛胸腺DNA的加入,在加入DNA后随即加入PEG4000;将42℃热冲击时间从5min延长到25min;热冲击后直接将转化混合物涂布到选择性平板上能得到高效转化效率。所用四种类型质粒的转化效率如下：Yrp;3．5—7．2×10⁴(线性pcN60／BamHⅠ：1·6×10⁵);Yep: l·7—2.6×10⁴(线性YEpl3／BarnHⅠ：8×10⁴),Ycp：3．7×10⁴;YIp5／stuI：7．6×10³。用快速法检测的7株受体菌的转化能力都达到10⁴个转化子/μg DNA。     

Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响

研究Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响。实验小鼠分为5组,每组有Smad3基因剔除小鼠（Smad3^-/-）和其同窝孪生的野生型小鼠（Smad3^+/+）各1只。小鼠的造血功能用14天形成的脾结节(CFUS14)、多系祖细胞（CFUGEMM）、粒单系祖细胞（CFUGM）、红系祖细胞（BFUE）测定及外周血象、骨髓象等实验血液学指标来确定。每组小鼠取尾血作白细胞、红细胞和血小板计数,涂片作白细胞分类计数。将一侧股骨的骨髓冲出,制成单细胞悬液,计数其中有核细胞数,测定CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM值。将每只小鼠的4×10⁴个骨髓有核细胞,经尾静脉注入3只8～10周经致死量射线照射的同系雌性小鼠体内,测定14天的CFUS。取一部分胸骨、肝脏、脾脏固定做病理切片,其余胸骨冲出骨髓,涂片作分类计数。结果Smad3^-/-小鼠外周血白细胞和血小板计数明显高于Smad3^+/+小鼠,红细胞数无显著差异。外周血白细胞分类结果也表明粒细胞显著增高。骨髓有核细胞数无显著差异,CFU-GM显著增高,BFU-E 无显著差异,CFU-GEMM明显减少,CFU-S显著减少。病理形态学观察发现骨髓增生极度活跃,以粒系为主,肝脾无显著差别。骨髓涂片分类表明粒系增多,粒系：红系比例增高。因此得出结论Smad3基因剔除使小鼠造血干祖细胞数目减少,而且干祖细胞分化异常,向粒系分化增多。Smad3基因对造血系统的作用与TGF-β的作用有相关性。     

地塞米松对HepG2细胞分泌载脂蛋白的影响

以培养的人肝癌细胞系HepG2为研究对象,采用“冻干浓缩培养液载脂蛋白测定法”,考察了地塞米松对HepG2细胞载脂蛋白(apolipoprotein,apo)AⅠ、AⅡ、CⅢ、B100及E分泌的影响.结果表明：地塞米松对HepG2细胞apoAⅠ和apoE的分泌有促进作用,对apoAⅡ、apoB100和apoCⅢ的分泌有抑制作用,且这种作用随地塞米松浓度的增加而增强.当培养液中地塞米松的浓度为5.5×10^－5mol/L时,apoAⅠ和apoE的分泌分别增加36.6%和49.4%（P＜0.01）,apoAⅡ、apoB100和apoCⅢ的分泌分别减少38.9%、31.9%和29.8%（P＜0.01）.