钙调素亲和层析柱的制备及其应用

钙调素琼脂糖亲和层析柱是研究和纯化钙调素结合蛋白的理想工具。本文介绍了牛脑钙调素的提取以及利用牛脑钙调素制备钙调素琼脂糖亲和层析柱的方法。用钙调素琼脂糖亲和层析,可以使牛脑钙调素依赖的PDE的纯度提高18倍;发现在小麦细胞壁中存在9种钙调素结合蛋白或亚基。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究Ⅱ.615小鼠肝细胞核RNA聚合酶A、B、C的提取、分离和鉴定

本文报道了从615小鼠肝细胞核提取和分离A、B、C三种RNA聚合酶的方法。在80mM硫酸铵离子浓度下,B酶能选择性地吸附在DEAE-纤维素DE52上,从而和A、C酶分开,用500mM硫酸铵洗脱,呈现单一的峰。在50mM硫酸铵离子浓度下,将A、C酶吸附在DEAE-SephadexA25上,经50-500mM硫酸铵线性梯度洗脱,得到A酶和c酶两个峰。测定了这三种酶对α-鹅膏蕈碱的敏感性。A酶是抗α-鹅膏蕈碱的(在最高浓度为200微克/毫升时,酶活完全不受抑制);B酶在α-鹅膏蕈碱浓度为0.2微克/毫升时,活性受到50％以上的抑制;C酶在α-鹅膏蕈碱浓度为100微克/毫升时,活性受到50％以上的抑制。用提取的B酶免疫母鸡,获得了抗B酶的抗血清,这种抗血清在双向免疫扩散实验中和B酶之间产生沉淀反应,而和A酶或C酶之间不产生沉淀反应。     

磷脂对乙酰胆碱酯酶的稳定性及磷酸化作用的影响

采用重组的方法,磷脂能显著地提高纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶在水溶液中保存的稳定性。牛脑磷脂酰丝氨酸及牛脑磷脂酰胆碱重组酶,在4℃条件下保存,皆有比对照更高的稳定性。酶与牛脑磷脂酰胆碱重组后,再分别于室温及37℃放置50天,其活力不下降。而对照的活力分别下降为重组前活力的1/2及1/4。在某些稀释条件下,牛脑及牛脊髓磷脂酰丝氨酸重组酶的活性迅速下降。稀释液中钙离子的存在,能阻止这种磷脂对酶的抑制作用。而磷脂酰胆碱重组酶及对照酶皆无此种在稀释条件下的活力迅速下降的现象。牛脑磷脂酰胆碱与酶的重组还能提高对氧磷与酶的反应活性。该重组酶与对氧磷反应的双分子速度常数高达9.0×10~8M~(-1)分~(-1)。因此,此种磷脂酰胆碱重组酶是酶分析法测定极低浓度有机磷化合物的一种较好的酶源。     

磷脂对乙酰胆碱酯酶的稳定性及磷酸化作用的影响

采用重组的方法,磷脂能显著地提高纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶在水溶液中保存的稳定性。牛脑磷脂酰丝氨酸及牛脑磷脂酰胆碱重组酶,在4℃条件下保存,皆有比对照更高的稳定性。酶与牛脑磷脂酰胆碱重组后,再分别于室温及37℃放置50天,其活力不下降。而对照的活力分别下降为重组前活力的1/2及1/4。在某些稀释条件下,牛脑及牛脊髓磷脂酰丝氨酸重组酶的活性迅速下降。稀释液中钙离子的存在,能阻止这种磷脂对酶的抑制作用。而磷脂酰胆碱重组酶及对照酶皆无此种在稀释条件下的活力迅速下降的现象。牛脑磷脂酰胆碱与酶的重组还能提高对氧磷与酶的反应活性。该重组酶与对氧磷反应的双分子速度常数高达9.0×10~8M~(-1)分~(-1)。因此,此种磷脂酰胆碱重组酶是酶分析法测定极低浓度有机磷化合物的一种较好的酶源。     

解木聚糖类芽孢杆菌木葡聚糖酶的分离纯化及酶学性质研究

解木聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus xylanilyticus)发酵液经硫酸铵分级沉淀、HiPrep26/10 Desalting柱脱盐、HiPrepDEAE FF16/10阴离子交换柱、HiPrep 16/60 Sephacryl S-100凝胶柱、HiPrep 16/10 Source 30S阳离子交换柱等,最终纯化出单一组分的木葡聚糖酶,经过SDS-PAGE电泳分析,此木葡聚糖酶相对分子量约为39 kD。该菌所产木葡聚糖酶的最适反应温度是50℃,在60℃以下较稳定;最适反应pH是7.0,在pH5.0-10.0范围内酶活力较为稳定。酶的动力学研究显示Km为65 g/L,Vmax为6.49μmol/min,kcat=10.86 s-1。底物特异性研究表明对木葡聚糖具有较高比活力。酶蛋白经质谱分析,比对结果显示与来源于Paenibacillus pabuli的木葡聚糖酶有较高同源性。本研究为首次报道解木聚糖类芽孢杆菌(P.xylanilyticus)产木葡聚糖酶。     

白色念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶的纯化与性质

利用硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sephacel离子交换层析从白色念珠菌WD27培养液中提纯得到一种蛋白酶,纯化倍数为25.4,收率为5.2％。其活性可被抑胃肽特异抑制,初步鉴定该酶为天冬氨酸蛋白酶。该酶在酸性范围内有水解蛋白活性,最适作用pH为4.0,最适温度为37℃。酶在pH5.0～6.0、45℃以下较稳定,该酶具有较广的底物作用范围,对牛血红蛋白最敏感。酶作用于牛血红蛋白的米氏常数Km为0.814mmol/L。     

牛脑Ca~(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ的纯化和鉴定

通过一系列层析法,首次从牛脑纯化得到胶凝电泳匀一的Ca~(2+)/CaM PKⅡ。凝胶过滤法测定全酶分子量为550kD,SDS-PAGE法测定亚基分子量为55kD,推测牛脑Ca~(2+)/CaM PK Ⅱ由十个相同的亚基组成。该酶活性绝对依赖于Ca~(2+)和CaM,以63kD PDE同工酶为底物,其AC_(50)分别为0.85μmol/L和0.18μmol/L;以酪蛋白为底物,其AC_(50)分别为0.22μmol/L和0.06μmol/L。牛脑Ca~(2+)/CaM PK Ⅱ旣能催化63kD PDE同工酶等多种蛋白或酶磷酸化,又能进行自身磷酸化。该酶催化63kD PDE同工酶最大磷酸参入量为1mol/mol亚基。磷酸化型63kD PDE同工酶的Ca~(2+)的AC_(50)高于非磷酸化型。     

锁阳原花青素提取方法及抗氧化和抗糖基化研究

为比较不同提取方法对锁阳原花青素得率、抗氧化性和抗糖基化活性的影响,本研究分别采用超声波法、乙醇/硫酸铵双水相萃取法、水提法、微波法和酶解法提取锁阳中原花青素,用香草醛-浓盐酸法测定原花青素含量。采用DPPH·清除能力和·OH清除能力衡量其体外抗氧化能力,采用牛血清白蛋白(BSA)-葡萄糖模拟反应体系和牛血清白蛋白-丙醛酸(MGO)模拟反应体系评价原花青素抗糖基化活性。结果表明:微波法提取得率最高,可达15. 00%,提取时间短,仅为19 min。不同提取方法对DPPH·清除能力依次为微波法酶法超声波法乙醇/硫酸铵双水相萃取法水提法;不同提取方法对·OH清除能力依次为:微波法酶解法超声法水提法乙醇/硫酸铵双水相萃取法。微波法制备原花青素在牛血清白蛋白-果糖模拟反应体系和牛血清白蛋白-丙酮醛模拟反应中均有最高抑制率;但抗氧化和抗糖基化活性无相关性。     

植物28kD蛋白的纯化及部分性质研究

经丙酮粉、硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析等方法,首次从玉米花粉细胞质粗提物中纯化了一种具有ＡＴＰａｓｅ活性的可溶性蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得分子量为２８ｋＤ,ＩＥＦ－ＰＡＧＥ测得等电点为８．３。免疫印迹鉴定结果表明该酶蛋白与抗牛脑动蛋白或动力蛋白的抗体无免疫交叉反应。最大紫外吸收波长为２７８ｎｍ,并作了ＣＤ谱分析。底物特异性研究表明：ＡＴＰａｓｅ水解活性最高。药理学研究表明：该酶蛋白可被矾酸钠强烈抑制,但对ＮＥＭ基本不敏感,氟化钠可使酶活力丧失５０％左右,寡霉素、硝酸钾及乌本苷对酶活力没有抑制作用．     

一株产右旋糖酐酶青霉的分离及酶的纯化和性质

[目的]从土壤中筛选到一株新的产右旋糖酐酶的真菌F1001,为酶法制备药用级右旋糖酐提供新的右旋糖酐酶产生菌株.[方法]通过形态特征和ITS rDNA序列分析方法鉴定菌株.利用硫酸铵盐析、Sepharose 6B凝胶柱纯化,得到纯度较高的酶蛋白.以右旋糖酐70 kDa为底物,对右旋糖酐酶酶学性质及催化机理进行研究.[结...     

牛脑皮支Gi的纯化及其与AC的偶联

用１％脑酸钠和２０％饱和度的硫酸铵抽提牛脑皮层细胞膜得到含Ｇ蛋白和腺苷酸环化酶（ＡＣ）的制剂,通过Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ柱将两分开,再将含Ｇ蛋白的级分用庚胺－Ｓｅｐｈａ５ｒｏｓｅ４Ｂ疏水柱、羟基磷灰石柱将其它亚型的Ｇ蛋白（主要是Ｇｓ和Ｇｏ）从抑制型Ｇ蛋白（Ｇｉ）中除去,获得纯化的较高的Ｇｉ,其ＧＴＰ结合活力为１７．６ｎｍｏｌ／ｍｇ,比细胞膜Ｇｉ活力提高５０倍;并具有较高的产率,从１ｇ膜蛋白扣可获     

姜老师信箱

蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第14期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,现在正在做有关茶叶、苹果等多酚氧化酶(PPO)分离纯化的实验,目的是为了得到PPO的纯品。目前我遇到一些困难,希望得到您的指点。我分离纯化PPO是通过匀浆、硫酸铵沉淀、DE-52阴离子交换柱、冻干进行的,我的问题如下:1.硫酸铵沉淀后的酶液,透析多久较合适?2.将酶液上样后,是     

锁阳原花青素提取方法及抗氧化和抗糖基化研究北大核心CSCD

为比较不同提取方法对锁阳原花青素得率、抗氧化性和抗糖基化活性的影响,本研究分别采用超声波法、乙醇/硫酸铵双水相萃取法、水提法、微波法和酶解法提取锁阳中原花青素,用香草醛-浓盐酸法测定原花青素含量。采用DPPH·清除能力和·OH清除能力衡量其体外抗氧化能力,采用牛血清白蛋白(BSA)-葡萄糖模拟反应体系和牛血清白蛋白-丙醛酸(MGO)模拟反应体系评价原花青素抗糖基化活性。结果表明:微波法提取得率最高,可达15. 00%,提取时间短,仅为19 min。不同提取方法对DPPH·清除能力依次为微波法>酶法>超声波法>乙醇/硫酸铵双水相萃取法>水提法;不同提取方法对·OH清除能力依次为:微波法>酶解法>超声法>水提法>乙醇/硫酸铵双水相萃取法。微波法制备原花青素在牛血清白蛋白-果糖模拟反应体系和牛血清白蛋白-丙酮醛模拟反应中均有最高抑制率;但抗氧化和抗糖基化活性无相关性。     

重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的高效表达与纯化

利用质粒pET-22b( )为表达载体,成功构建了高效表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因工程菌BL21-pET-22b( )-argE。研究了该菌的最适超声破壁条件及硫酸铵分级沉淀的最适范围,并以金属螯合亲和层析法纯化含有6-His-Tag的目的蛋白。结果表明:26℃诱导表达的菌体,最佳超声破碎条件为功率200 W,超声时间为15min;目的蛋白主要存在于40%~50%硫酸铵沉淀中。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,可以达到SDS-PAGE电泳纯,并显示单亚基相对分子质量为43 000。纯化倍数为139倍,回收率为11.1%。     

链霉菌SO1菌株几丁质酶的纯化及性质

由链霉菌（Streptomycessp.）SO1菌株产生的几丁质酶（Citinase）经硫酸铵盐析、OEAE纤维素柱层析、SephadexG－100柱层桥分离纯化后,得到SDS－PAGE均一样品。用SDS－PAG测得纯化后的几丁质酶分子量为41Ku,用PAGEIEF测得等电点PI为5.4。酶反应的最适pH值为6．0,最适温度为50℃,在pH5．0～9．0、温度30～50℃时酶活性比较稳定。在相当于0.1mol／LNaCl的离子强度下酶活性最高。金属离子中的Mg²⁺、Ca     

菜豆幼苗EPSP合成酶的分离纯化和它的部分性质

利用硫酸铵分级沉淀,SephedexG-50凝胶柱层析,FPLCMono-Q和磷酸纤维素离子层析法从菜豆幼苗中分离提纯了EPSP合成酶。该酶被纯化2961.6倍,比活性达到6219.4nmolmg-1蛋白min-1。该酶分子量经SDS-PAGE检测为51kD,等电点为pH5.7,酶促反应最适pH7.5,最适温度45℃。6.2μmol/L的除草剂草甘膦能抑制EPSP合成酶活性的50%。     

仓鼠肝谷胱甘肽过氧化酶的提纯与鉴定

用硫酸铵分级沉淀后,经过Phenyl-sepharose CL-4B和DEAE-SephadexA-50柱层析分离得到了比活为1993units/mg、纯化倍数为443倍、产率为12％的仓鼠肝谷胱甘肽过氧化酶。提纯的酶在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带。     

牛脑皮层G_i的纯化及其与AC的偶联

用1％胆酸钠和20％饱和度的硫酸铵抽提牛脑皮层细胞膜得到含G蛋白和腺苷酸环化酶（AC）的制剂,通过Sepharose6B柱将两者分开,再将含G蛋白的级分用庚胺-Sepharose4B疏水柱、羟基磷灰石柱将其它亚型的G蛋白（主要是Gs和Go）从抑制型G蛋白（Gi）中除去,获得纯化的高活力的Gi,其GTP结合活力为17．6nmol／mg,比细胞膜Gi活力提高50倍;并具有较高的产率,从1g膜蛋白中可获得0．66mg的Gi,同时可获得无G蛋白污染的AC和少量的Gs蛋白．SDS-PAGE显示分子量为41000和36000的两条蛋白带,证实是Gi的α基和β亚基．进一步用重建脂酶体的方法检测Gi对AC的抑制作用,结果显示Gi对AC活力的抑制达40％左右,表明CAMP信息跨膜转导通路中Gi与AC之间具有较好偶联功能．     

一步肝素琼脂糖亲和层析法分离纯化限制性核酸内切酶Pst1

Ⅱ型限制性内切酶是重要的工具酶。它的提纯方法,以前一般是破碎细胞,超速离心取得酶的粗提液后,先除去核酸,后用硫酸铵部分沉淀除去部分杂蛋白,再用各种柱层析法进一步纯化。Greene等人在1978年建立了直接用酶的粗提液,经过磷酸纤维素和羟基磷灰石两步柱层析提取酶的方法,所得酶制剂中不夹杂其它脱氧核糖核酸酶。此法较简便快速,已为国内外所采用。 Baksi等人报道用一步Cibacron Blue F3GA-琼脂糖亲和层析提取BamHl等酶。George等人报道Pstl的粗提液只经过这一步柱层析     

抗氧化型枯草杆菌碱性蛋白酶高产工程菌的构建——Ⅰ.抗氧化型碱性蛋白酶的提纯及其主要性质的研究

枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)B135工程菌能产生抗氧化型碱性蛋白酶,粗酶经硫酸铵分级沉淀,CM-52层析,Sephadex G-100层析,得到凝胶电泳均一样品,比活达到1700U/mg,是粗酶比活的7.69倍.该酶在60℃时酶活力最高,最适pH为10.2,在50℃时,温浴10min后,酶活降低到原来的50%.该酶受1M H_2O_2作用20min后,仍保持96%的酶活