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毕赤酵母表达系统是近年来发展最为迅速的一种新型外源蛋白真核表达系统,被广泛应用于多种不同领域且成功表达了许多基因工程产品。高密度发酵技术已被广泛运用到毕赤酵母工程菌发酵工程当中。主要从毕赤酵母的表达常用菌株、载体及表型等方面介绍了其表达系统,从外源基因自身的特性、培养基的组成、温度、pH、溶氧量及补料流加策略方面阐述了对毕赤酵母高密度发酵的过程及蛋白质表达结果的影响,并对毕赤酵母工程菌高密度发酵进行了展望,为其今后的研究及应用提供借鉴。 相似文献
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毕赤酵母高密度发酵工艺的研究 总被引:9,自引:0,他引:9
林俊涵 《中国生物工程杂志》2009,29(5):120-125
高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH和变温发酵,提高DO,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLFB)、氧气限制补料(OLFB)、甲醇不限制补料(MNLFB)和温度限制补料(TLFB)。采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(qMeOH)为0.02-0.03gg-1h-1,而菌体不生长时,qMeOH采用较高值。 相似文献
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重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶 总被引:1,自引:0,他引:1
对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵条件进行了试验,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料方式的研究。在摇瓶发酵时,最佳种龄为16h,接种量为3%,甲醇的诱导浓度为15g/L,生长阶段最适pH为5.0,诱导阶段最适pH为5.5。在间歇补料、恒速补料、变速补料三种补料方式中以变速流加最优。 相似文献
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重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA 总被引:11,自引:0,他引:11
对基因工程菌Pichiapastoris的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌P .pastoris表达重组人血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 1 0g L ;发酵pH范围为 5 72~ 6 5 9;在摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产率却明显下降 ,符合y =1 2 941x- 0 50 59方程 (线性相关系数r=0 9789) ,其限制性因子很可能为溶氧。在分批发酵 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 (OD60 0 )为 2 0左右时 ,细胞生长的延迟期为 2 1 1h左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y =0 7841e0 .2 3 19t(线性相关系数r=0 .993 6 ) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 1 1 5g L— 1 6 0g L ,在 1 2 0h重组人血清白蛋白表达量最大达到 3 6g L。 相似文献
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首次尝试将钠氏法应用于毕赤酵母高密度发酵中,并与靛酚蓝检测法进行了比较,证实钠氏法在0~10 mg/L的范围内,相关性好(r2=0.996 5),精确度(RSD=2.14%~5.32%)和精密度(Prec ision=97%~105%)高,更适合于毕赤酵母发酵中氨态氮含量的检测。并对其检测条件进行优化,确定检测波长为400 nm,最佳的显色反应为10 min。该方法用于毕赤酵母高密度发酵表达重组人血清白蛋白胸腺肽的结果表明,在发酵液氨基氮含量低于1.5 mg/kg,重组目的蛋白的表达出现了明显的降解,改善并控制发酵液中氨态氮的含量后,可以明显控制目的蛋白的降解,提高产品的产率。结果证实该方法用于发酵液中氨态氮的检测时,准确可靠,切实可行。 相似文献
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重组毕赤酵母发酵牛肉风味肽的中试研究 总被引:2,自引:0,他引:2
研究分泌表达16拷贝牛肉风味肽(beefy meaty peptide, BMP)毕赤酵母工程菌株(Pichia pastoris GS115-16B2)的500L发酵罐中试发酵工艺。在500L发酵罐中采用三步发酵法进行了3批次中试发酵实验,设定菌体培养阶段温度为30℃,pH5.0,诱导表达阶段温度为28℃,pH3.0。在发酵程中通过调节搅拌速度、通气量和罐压等措施来使DO维持在20%~35%左右,总共发酵126h(诱导时间为96h),当诱导88h后(发酵118h),600nm波长下的光密度值(OD600)达到184.5,菌体湿重达到318.7g/L,目的产物BMP的表达量达到最高为172 mg/L,实现了BMP的高效表达。通过中试发酵初步建立了工程菌P. pastoris GS115-16B2的中试发酵工艺,为BMP的进一步研究开发奠定了良好基础。 相似文献
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为提高重组毕赤酵母生产人血清白蛋白-C肽融合蛋白(HSA—CP)的产量和生产强度,在摇瓶条件下考察了甲醇诱导时间和浓度对目的蛋白产量的影响。结果表明,质量浓度10g/L的甲醇诱导72h最适于产物表达。通过对7L发酵罐中各因素的优化,得到最佳条件为:初始甘油质量浓度10g/L,30℃培养,菌体生长期和诱导期的pH及溶氧分别控制在pH5.0、30%溶解O2或pH6.0、15%的溶解O2。10g/L的甲醇诱导72h,最终使干细胞质量浓度达到56.43g/L,目的蛋白产量达368.45mg/L。生产强度为3.920mg/(L·h),目标蛋白的比生产速率为5.12mg/(L·h)。 相似文献
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目的:通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进,建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白(EH)的中试发酵工艺,为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法:首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线,然后根据生长曲线,将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后,直接接种到500 L的发酵罐中放大培养,通过发酵液的D600nm值、溶氧值(DO2)及菌体湿重动态监测细菌的生长状态,并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白;表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白;用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度;用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量;用Western印迹验证目的蛋白;用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果:发酵结束时,上清中蛋白含量达1.41 g/L,经后期分离纯化,得到约21 g EH蛋白,SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13.2×103±0.2×103,质谱分析相对分子质量约为7.3×103±0.73×103;Western印迹表明检测条带为目的蛋白,能被抗水蛭素抗体特异性结合;非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95%;凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512~1024 ATU/mg。结论:建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。 相似文献