基于rDNA ITSl和ITS2序列的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的分子鉴定

本研究测定了褐飞虱 Nilaparvata lugens、白背飞虱 Sogatella furcifera 和灰飞虱Laodelphax striatellus 的rDNA ITSl和ITS2的序列,以探讨这3种稻飞虱的分子鉴定方法.3种飞虱的ITSI和ITS2侧翼区(18S,5.8S和28S)序列相对稳定,但ITS1和ITS2序列在3种飞虱中变异较大.ITS1在所分析的438个位点中可变位点达294个,ITS2在分析的403个位点中可变位点为177个.根据3种飞虱rDNA的ITS1和ITS2序列设计了特异性引物,应用特异性引物对样品进行了PCR扩增,分析发现3种飞虱ITS1区的特异性引物扩增效果不理想.而ITS2区的特异性引物可以稳定地扩增出明显的目的DNA条带.因此,采用ITS2区的特异性引物可以对3种飞虱进行快速的分子鉴定.     

稻飞虱种群发生的调查与取样技术

稻飞虱是中国和许多国家水稻生产上的主要害虫,属r对策暴发危害类型。其中,褐飞虱和白背飞虱是典型的远距离迁飞性害虫,具有大区域同期"突增"和"突减"的灾变特性;灰飞虱则主要以本地越冬为主,远距离迁飞对种群结构的影响较小,但其传播的病毒病对水稻生产的影响更甚。针对3种稻飞虱的生物学特性,本文发展了稻飞虱田间种群发生与危害等的调查与取样技术,为其种群发生及其监测预警提供技术支撑。     

褐飞虱中肠内膜结合短肽P2S的筛选

筛选与褐飞虱Nilaparvata lugens中肠内膜相结合的短肽, 探索能阻断褐飞虱传播水稻病毒的新方法。【方法】通过改良的膜饲喂法和噬菌体短肽文库展示技术, 模拟褐飞虱正常取食的行为, 筛选能够与其中肠内膜结合的短肽。将筛选到的短肽与加强绿色荧光蛋白进行融合表达, 经纯化后, 将融合蛋白饲喂给褐飞虱若虫, 通过荧光显微镜观察饲喂后若虫的中肠。【结果】使用改良的膜饲喂法, 16 h后褐飞虱若虫的取食率达到91%, 24 h后达到95%。经形态学验证, 确定了一种短肽与褐飞虱中肠内膜具有结合活性, 并将其命名为P2S。【结论】改良了针对褐飞虱的膜饲喂法, 筛选并验证了能够与褐飞虱中肠内膜结合的活性短肽P2S。研究结果为阻断相关的水稻病毒与褐飞虱中肠内膜间的相互作用研究提供了科学依据, 也为褐飞虱新型膜穿孔毒素蛋白的研究提供了理论基础。     

稻飞虱迁飞种群的上灯行为节律研究

【目的】明确稻飞虱迁飞种群的上灯行为节律,以指导其大田迁入种群和迁出种群的发生预测与灾变预警。【方法】本研究运用逐时自动灯诱装置对2010和2011连续两年稻飞虱迁飞种群的上灯行为节律进行了系统研究。【结果】灰飞虱Laodelphax striatellus迁飞种群上灯始见期和灯诱虫量年际间差异不明显,白背飞虱Sogatella furcifera和褐飞虱Nilaparvata lugens迁飞过境种群上灯始见期和灯诱虫量年际间差异较大。此外,灰飞虱迁飞种群的特大高峰期和高峰期逐时灯诱虫量百分比与一般上灯期和零星上灯期相比突出了晨暮双峰型中的暮峰型上灯行为特点;白背飞虱迁飞种群特大高峰期逐时灯诱虫量百分比与高峰期和一般期相比突出了晨暮双峰型中的晨峰型生物学特性。【结论】稻飞虱迁飞种群的上灯行为节律存在种的特异性,这一行为节律除了受环境因素的影响外主要与其生物学特性有关。     

褐飞虱与灰飞虱间接种内和种间效应的比较研究

为了明确褐飞虱Nilaparva talugens(Stl)与灰飞虱Laodelphgax striatellus(Fallén)经寄主植物而诱导引起的间接种间效应,在人工气候室内以健康植株为对照,研究了2种飞虱在事先分别经一种稻飞虱危害的汕优63和秀水11上的表现,比较由同种或异种诱导的间接种内和种间效应对该2种稻飞虱主要生物学参数的影响,结果表明在每2株稻苗接20头高龄单一种飞虱若虫危害2d的条件下,褐飞虱存在一定的间接种内竞争,主要表现为在事先由同种危害的寄主上若虫存活率显著下降,但未发现灰飞虱对褐飞虱的正面或负面的间接种间效应。但是,在试验条件下灰飞虱并不存在间接种内竞争,而存在着显著的褐飞虱对灰飞虱诱导的间接种间促进作用,主要表现为在事先经褐飞虱取食危害的寄主植物上灰飞虱若虫的历期缩短、存活率提高、雌成虫寿命延长、每雌产卵量增加。同时,褐飞虱对灰飞虱所表现的间接诱导种间促进效应与寄主品种有显著互作关系,在中抗灰飞虱的汕优63品种上,间接诱导种间促进效应较在感灰飞虱品种秀水10上更为明显。本文对稻飞虱间接诱导种内和种间效应的机制和进化意义进行了讨论。     

Influence of pymetrozine on feeding behaviors of three rice planthoppers and a rice leafhopper using electrical penetration graphs

Pymetrozine reportedly inhibits feeding of plant sap-sucking insects, such as aphids and brown planthopper (Nilaparvata lugens (St?l)). By using electrical penetration graph (EPG), this study was conducted to investigate any differential effect of pymetrozine on the feeding behaviors of four major rice sap-sucking insect species, 1) N. lugens, 2) white-backed planthopper (Sogatella furcifera (Horváth)), 3) small brown planthopper (Laodelphax striatellus (Fallen)), and 4) green rice leafhopper (Nephotettix cincticeps Uhler). On pymetrozine-free TN1 rice plants, white-backed planthopper and small brown planthopper showed a significantly less activity in the phloem phases than brown planthopper or green rice leafhopper while green rice leafhopper engaged in relatively more xylem ingestion than brown planthopper, white-backed planthopper, and small brown planthopper. On the plants treated with 100 mg liter(-1) of pymetrozine, all four insect species showed significant increases, in total duration of nonprobing and significant decreases in the activities in phloem tissue, while all species showed similar feeding behavior during the pathway and xylem phases. This study revealed that, regardless of whether the insects on untreated plants spent more time feeding on phloem than xylem (brown planthopper) or more time on xylem than phloem (green rice leafhopper) or similar times on phloem and xylem (white-backed planthopper and small brown planthopper), their feeding behavior was disturbed by pymetrozine and exhibited similar patterns of sharp decline in activity in the phloem tissue and a significant increase the nonprobing.     

小黄家蚁工蚁对褐稻虱的捕食作用

报道了小黄家蚁对褐稻虱的捕食作用．养虫笼及大试管捕食试验结果表明,小黄家蚁对褐稻虱若虫尤其是低龄若虫具有良好的捕食效果,捕食率分别为９３％和３０％,捕食的功能反应为ＨｏｌｉｎｇⅡ型反应,水稻品种抗性与捕食反应之间存在协同作用．     

山东省不同地区灰飞虱对溴氰虫酰胺的敏感性及亚致死剂量溴氰虫酰胺对灰飞虱解毒酶活性的影响

为了探究山东不同地区灰飞虱种群对溴氰虫酰胺的敏感性水平差异,在室内采用稻苗浸渍法和点滴法分别测定了溴氰虫酰胺对泰安、莱芜、鱼台(分别采自小麦和水稻)、济南和济阳6个灰飞虱种群3龄若虫和成虫的毒力,同时测定了亚致死剂量(LD 10和LD 30)溴氰虫酰胺对灰飞虱成虫体内的酯酶(ESTs)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFO)活性的影响。稻苗浸渍法结果表明,溴氰虫酰胺对6个灰飞虱种群3龄若虫的LC 50值介于8.5193~11.0524 mg/L,对成虫的LC 50值介于10.4245~12.4904 mg/L。点滴法测定结果表明,溴氰虫酰胺对6个灰飞虱种群3龄若虫的LD 50值在0.9239×10-3~1.1318×10-3μg/头之间,对成虫的LD 50值在1.0933×10-3~1.2619×10-3μg/头之间。在溴氰虫酰胺亚致死剂量(LD 10和LD 30)处理下,灰飞虱体内3种解毒酶活性均被诱导上升,其中GSTs酶活力上升最显著。结果表明,山东不同地区田间灰飞虱种群对溴氰虫酰胺的敏感性差异不大,同一地区灰飞虱种群不同虫态对溴氰虫酰胺的敏感性也无明显差异。GSTs可能会在灰飞虱对溴氰虫酰胺后续抗性形成中起作用。     

不同药剂对褐飞虱作用特性的比较

为高效和合理利用化学药剂防治褐飞虱Nilaparvta lugens( St(a)l),采用浸苗法和喷雾法测定了噻虫嗪、烯啶虫胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯噻啉和乙虫腈5种药剂对褐飞虱的作用活性和速度,同时还比较了噻虫嗪和烯啶虫胺对褐飞虱不同龄期若虫的作用活性.结果表明,在5种供试药剂中,从作用活性来看,无论是用浸苗法...     

褐飞虱细胞色素P450单加氧酶基因CYP4CE1的克隆及表达谱

为了解P450基因在褐飞虱Nilaparvata lugens适应水稻品种过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）,快速扩增cDNA末端（RACE）和长距离聚合酶链式反应（LD-PCR）技术,克隆了褐飞虱4龄若虫的CYP4家族的一个P450单加氧酶基因,被命名为CYP4CE1。该基因的全长cDNA序列（2 160 bp）含有一个1 626 bp的开放阅读框（ORF）,编码541个氨基酸残基的蛋白质。通过GenBank数据库中的blastx搜索引擎进行同源性分析,结果表明CYP4CE1编码的蛋白与岸蟹 Carcinus maenas的CYP4C39（GenBank登录号：JC8026）的相似性最高,两者的氨基酸序列同源性达43％;其次与热带蟑螂 Blaberus discoidalis的CYP4C1（AAA27819）及黑腹果蝇Drosophila melanogaster的CYP4C3（NP_524598）的相似性也较高,氨基酸序列同源性分别达42％。氨基酸序列比对表明该蛋白含有CYP4家族成员的所有保守特征序列,如螺旋K（E--R--P）,氧结合结构域即螺旋I（AG--T）,血红素结合区（PF--G---C-G--F）以及CYP4成员的特有特征序列（EVDTFMFEGHDTT）等。使用Northern杂交检测CYP4CE1随时间的表达变化,结果表明：与饲养于感虫水稻台中1号（Taichung Native 1,TN1）上的若虫相比,在取食中度抗性水稻Minghui 63（MH63）秧苗12,24,48,72 h的各时间段的褐飞虱体内,该基因有2.1倍的过量表达且表达水平保持稳定。进一步通过Northern杂交检测该基因的组织表达特异性,结果显示：该基因在取食TN1秧苗的若虫脂肪体中表达量最高,在肠道组织及体壁中的表达水平较低;褐飞虱取食MH63秧苗24 h后,该基因在体壁及脂肪体中的表达量略有上升（各约1.2倍）,而在肠道组织中的表达量则大幅升高（约12倍）。肠道整体原位杂交表明,CYP4CE1在取食TN1秧苗的若虫的肠道组织及马氏管中均有本底水平的表达;若虫取食MH63秧苗后,该基因在上述肠道各区段表达水平明显增强。结果提示,在褐飞虱与水稻互作过程中CYP4CE1的重要功能之一可能是参与水稻有毒次生物质的代谢。     

绿僵菌及其与dsRNA混合使用对褐飞虱的防治效果

褐飞虱Nilaparvata lugens Stl是我国重要的迁飞性水稻害虫,本文研究了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae及其与dsRNA混合使用对褐飞虱的防治效果。绿僵菌悬浮液1.6×108孢子/m L至8×106孢子/m L对褐飞虱2龄、4龄和成虫进行喷药,发现1.6×107孢子/m L对各个虫态虫龄均有良好致死效果,并且成虫和4龄若虫均好于2龄若虫。在交配行为上来看,绿僵菌处理过的褐飞虱成虫活跃度非常低,从配对开始一直到交配结束的各个阶段都受到明显影响,处理组3 h的交配率只有3.70%,而对照组的交配率为24.44%。还把褐飞虱几丁质合成酶基因A的dsRNA与绿僵菌混合使用防治褐飞虱2龄和4龄若虫,结果表明0.5μg/μL ds CHSA与绿僵菌混合使用的防治效果最好,2龄若虫的死亡率为89.63%,4龄若虫的死亡率达到93.94%。而0.2μg/μL ds CHSA与绿僵菌的混合,对2龄和4龄若虫的致死率为65.56%-76.52%。研究结果为褐飞虱的生物防治提供了新的思路。     

褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

【目的】植食性刺吸式口器昆虫的唾液蛋白参与调控植物抗虫防御反应,影响其对寄主植物的适应性。本研究旨在通过克隆褐飞虱Nilaparvata lugens重要唾液蛋白基因Nl15,调查其时空表达模式,明确其在褐飞虱致害性中的作用。【方法】基于褐飞虱IR56种群转录组数据,用RT-PCR克隆褐飞虱基因Nl15 cDNA序列,并进行生物信息学分析。利用qPCR检测其在褐飞虱TN1和IR56种群不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和雌雄成虫)和雌成虫不同组织(头、胸、腹和足)中的表达模式。通过显微注射dsRNA对褐飞虱TN1和IR56种群的4龄若虫进行Nl15的RNAi,利用qPCR检测Nl15 RNAi后褐飞虱若虫中Nl15的相对表达量以及Nl15 RNAi后褐飞虱若虫取食3 d时水稻植株中防御相关基因(OsLecRK4, OsMPK10, OsWRKY24, OsLox, OsNPR1和OsGns5)的相对表达量,并生物测定Nl15 RNAi后褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量。【结果】克隆了褐飞虱Nl15 cDNA序列(GenBank登录号：OK181113),其开放阅读框长1 008 bp;预测编码335个氨基酸,理论等电点为7.54,分子量为38.7 kD,含有23个氨基酸的信号肽序列和一个糖基化修饰位点,不存在跨膜结构域和其他已知的功能域;Nl15与灰飞虱Laodelphax striatellus同源蛋白氨基酸序列一致性为45%。发育表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱各个发育阶段均表达,在3-4龄若虫中的表达量最高;组织表达谱结果表明,Nl15在褐飞虱雌成虫头部中的表达量最高,且在IR56种群头部中的表达量高于在TN1种群头部中的。RNAi实验结果表明,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsNl15的处理组中Nl15的表达量显著降低了89.5%,褐飞虱的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低,上述6个水稻防御相关基因的表达量显著上调。【结论】褐飞虱IR56种群中的Nl15参与褐飞虱与水稻的防御与反防御分子互作。本研究为进一步阐述褐飞虱克服抗虫基因的机制及揭示昆虫与植物互作的分子网络提供了思路。     

褐飞虱磷脂酰肌醇3激酶p85α亚基基因NlPIK3R1的克隆与功能分析

【目的】PI3K信号通路在生物体中发挥重要功能,涉及糖和脂质的代谢、细胞和组织生长以及生物个体寿命等。本研究旨在探明该通路中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在褐飞虱Nilaparvata lugens中的功能。【方法】根据转录组提供的PI3K p85α核心序列信息,应用c DNA末端快速克隆的技术(RACE)获得了编码PI3K p85α的基因Nl PIK3R1的全长c DNA(Gen Bank登录号为KP635379),并应用荧光定量PCR和通过给成虫喂食ds Nl PIK3R1对Nl PIK3R1进行RNA干扰(RNAi)分别对该基因的表达规律和功能进行了研究。【结果】荧光定量PCR测定结果表明,Nl PIK3R1在褐飞虱若虫和雄成虫中表达量均较低,但在怀卵雌成虫中大量表达。RNAi结果表明,给褐飞虱成虫喂食0.1和0.5μg/μL ds Nl PIK3R1均导致Nl PIK3R1的表达明显受到抑制,高浓度组的抑制效果尤为明显。喂食ds Nl PIK3R1对褐飞虱成虫具有极显著致死效果,高浓度组的褐飞虱成虫在饲喂第7天时存活率仅为37.5%,相比于空白对照组(87.00%)和ds GFP对照组(76.67%)均达到了极显著差异(P0.01)。对Nl PIK3R1的RNAi导致褐飞虱成虫羽化率下降和体重变轻。【结论】本研究结果显示,Nl PIK3R1基因对褐飞虱的生存、生长和发育具有重要作用,可以作为防治褐飞虱的潜在靶标。     

灰飞虱中IKK相关基因的鉴定及其在水稻条纹病毒侵染中的功能

【目的】本研究旨在鉴定灰飞虱Laodelphax striatellus中的IκB激酶(IκB kinase, IKK)相关基因,并调查其在灰飞虱抗病毒中的作用,以进一步深入理解传毒介体应对植物病毒的先天免疫机制。【方法】通过生物信息学鉴定了灰飞虱基因组中IKK相关基因;以无毒及水稻条纹病毒(rice stripe virus, RSV)侵染的灰飞虱为材料,利用RT-PCR方法检测IKK相关基因在无毒灰飞虱各个龄期(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)及成虫不同组织(肠道、唾液腺、血淋巴、脂肪体、卵巢和精巢)中的表达量;利用qRT-PCR方法检测无毒以及RSV侵染后的灰飞虱IKK相关基因在各个龄期及成虫不同组织中的表达量;通过对3龄若虫注射IKK基因dsRNA进行RNA干扰后,利用qRT-PCR检测带毒灰飞虱中表示病毒含量的RSV外壳蛋白(CP)基因转录水平。【结果】在灰飞虱基因组中鉴定到了两个IKK相关基因即IKKα(GenBank登录号:MK903504)和TANK结合激酶1(TANK-binding kinase1)基因TBK1(GenBank登录号:MN124506)。IKKα开...     

灰飞虱热激蛋白Hsp90基因的克隆、序列分析与表达模式

【目的】灰飞虱Laodelphax striatellus (Fallén)是水稻上的重要害虫,它严重影响了水稻的产量和品质,特别由其传播的水稻条纹叶枯病毒对水稻的危害甚至更为严重。灰飞虱分布广,对环境有很强的适应性。本研究旨在探讨灰飞虱对温度胁迫适应的分子机制进行了初步的探讨。【方法】本研究采用RT-PCR与RACE技术克隆了热激蛋白Hsp90基因的全长,利用各种生物信息方法分析了该热激蛋白的特征,实时荧光定量PCR技术用于研究Hsp90基因在不同生长发育阶段和不同温度条件下表达变化规律。【结果】我们获得一条Hsp90 基因的cDNA全长序列,命名为LsHsp90（GenBank登录号为KF660250）。 LsHsp90全长为2 740 bp,编码729个氨基酸,等电点为5.0,分子量为83.7 kDa。氨基酸序列中含有 Hsp90蛋白家族的5个签名序列及胞质特征序列 MEEVD。结构预测表明LsHsp90具有Hsp90蛋白家族典型的结构特征。系统进化关系分析表明它与多种昆虫的Hsp90序列有较高的同源性。不同发育阶段的灰飞虱体内LsHsp90表达水平处于动态的变化过程中,并在4龄若虫期达到最大值,最低表达量在其雌成虫阶段。不同性别的灰飞虱成虫体内LsHsp90表达量有显著差异（P =0.008）。高温和低温胁迫都可以诱导灰飞虱体内LsHsp90的表达,最大的表达量分别在 40℃和-9℃。在40℃下处理不同时间后发现,LsHsp90的表达水平在处理后0.5 h时最高,但随着时间的延长,LsHsp90的表达水平逐渐降低。而在-4℃下,LsHsp90的表达水平在处理后1 h时达到最大值。【结论】灰飞虱体内的LsHsp90可以响应温度的诱导,它可能在灰飞虱温度胁迫适应过程中起到重要的作用。     

黄绿绿僵菌对褐飞虱和白背飞虱不同发育阶段的病原性的研究

本文报道了不同孢子浓度下黄绿绿僵菌对褐飞虱和白背飞虱不同发育阶段的易感性和毒力的研究。实验设10.5孢子/mm2,116.7孢子/mm2和1027.1孢子/mm2三种孢子剂量,两种飞虱分为幼龄若虫(1龄和2龄若虫)、高龄若虫(3、4、5龄若虫)和成虫三个发育阶段。实验发现褐飞虱与白背飞虱的三个发育阶段对黄绿绿僵菌的不同浓度的孢子液有不同程度的易感性。黄绿绿僵菌对褐飞虱幼龄若虫的毒力指标LT50在三种孢子剂量下依次为>21、20.82和16.55;对高龄若虫的LT50在三种孢子剂量下依次为17.68、15.49和13.98;而对成虫的LT50在三种孢子剂量下依次为17.10、12.57和9.14。黄绿绿僵菌对白背飞虱幼龄若虫的毒力指标LT50在三种孢子剂量下依次为>21、17.29和13.13;对高龄若虫的LT50在三种孢子剂量下依次为16.94、15.02和13.03;而对白背飞虱成虫的LT50在三种孢子剂量下依次为12.78、10.16和7.64。二者的成虫的易感性比若虫的易感性强,高龄若虫的易感性比幼龄若虫的强。白背飞虱比褐飞虱对黄绿绿僵菌更加敏感。二者的死亡率随孢子浓度的增大而增大。     

Brown planthopper, Nilaparvata lugens, resistance in rice cultivar IR64: mechanism and role in successful N. lugens management in Central Luzon, Philippines

We investigated the mechanism of brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål), resistance in the popular rice cultivar IR64, and the current level of resistance of IR64 to N. lugens in a large rice growing area with low brown planthopper populations (Central Luzon, Philippines). In greenhouse experiments with N. lugens populations collected from Central Luzon, IR64 showed slight to moderate levels of antibiosis, antixenosis, and tolerance relative to the cultivars IR22 and Azucena, which contain no major genes for N. lugens resistance. IR64 was also more resistant than IR26 in most experiments, despite the fact that both varieties have the same major gene for N. lugens resistance, Bph1. This confirms that IR64 contains one or more additional, apparently minor, genes for brown planthopper resistance. Our findings also demonstrate that, in an area with low insecticide use, it is not necessary to have high levels of N. lugens resistance, even in a rice cultivar grown by the majority of farmers, to maintain low and stable N. lugens populations.     

吡虫啉对褐飞虱DNA甲基化多态性的影响

为了探知基因组甲基化是否参与了昆虫抗药性, 本研究在室内对褐飞虱 Nilaparvata lugens连续9个世代的3龄若虫施用吡虫啉, 用AFLP检测褐飞虱抗性产生过程中DNA甲基化多态性的变化。利用25对AFLP引物共获得120个位点, 其中15个位点呈现甲基化多态性, 共获得78条多态性条带。根据多态性条带在不同世代样本中出现的多少计算多态性条带比例, 其中最高比例出现在G5代（10.26%）, 最低比例出现在G6代（1.28%）。多态性条带在不同世代间比例的变化趋势表明, 褐飞虱对吡虫啉的筛选产生快速应答。在筛选早期（G1, G2和G3）世代间DNA甲基化多态性比例差异相对较小, 变化范围在3.85%～6.41%之间; 在筛选中期（G4, G5和G6）世代间比例差异较大, 变化范围在1.28%～10.26%之间; 在筛选后期（G7, G8和G9）世代间比例差异相对较小, 变化范围在5.13%～7.69%之间。结果说明, 吡虫啉的连续施用能够诱导褐飞虱基因组产生甲基化变异, 初步揭示甲基化在褐飞虱抗药性产生过程中参与了基因组的表达调控。