一株嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性

研究了液体发酵嗜热毛壳菌Chaetomium thermophile产生的β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为78.4kDa和81kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为60℃和4.5-5.0。有较好的酸稳定性和热稳定性。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大, 其中Ca2+对酶有激活作用, 而Ag+、Cu2+ 、Hg2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。     

灰绿曲霉β-葡萄糖苷酶的分离及特性

目的：利用灰绿曲霉EU7-22发酵产纤维素酶,从中分离到β-葡萄糖苷酶,分析其理化特性,确定其最佳活性条件。方法：灰绿曲霉EU7-22发酵液离心后,上清液经硫酸铵沉淀、Phenyl 6 Fast Flow（highsub）疏水层析和Sephacryl S-200凝胶层析,获得纯化的β-葡萄糖苷酶。结果：纯酶的比活性为5.1 IU/mg,得率为13.89%。SDS-PAGE凝胶电泳分析表明该酶是单亚基蛋白,其分子量为56.2 kDa。在pH4.0~6.0范围内,β-葡萄糖苷酶具有较高的稳定性,该酶的最适酶促反应pH为5.0。当β-葡萄糖苷酶在温度低于60℃的缓冲液中温育1 h后,酶活损失不大,表现了较好的稳定性;当该酶在温度高于60℃的缓冲液中温育1 h后,酶活迅速丧失。β-葡萄糖苷酶在70℃时具有最大催化活性。结论：灰绿曲霉EU7-22发酵产生的β-葡萄糖苷酶具有较高活性,具有分子量较小、最佳催化温度较高的特点。     

β-环糊精葡基转移酶的纯化方法及酶学性质的研究

β-环糊精葡基转移酶的粗酶液应用酚酞分光光度法测得该酶的环化活性为11.79U/mL。该粗酶液先经过淀粉-酒精沉淀或淀粉-硫酸铵沉淀初步纯化,然后经Sephacryl S-100凝胶层析后,比活力分别提高了16、21、50倍,由原来的11.44U/mg蛋白质增加到572.67U/mg蛋白质,回收率分别为72.4%、66.4%、40.9%,经SDS-PAGE电泳显示为单一的蛋白带,酶的分子量约为70kDa。酶学性质研究表明该酶的最适pH和最适温度分别为6.0和60℃,在pH6.0~10.0范围内,55℃以下保温30min基本保持稳定。纯化后的β-环糊精葡基转移酶的环化活性每克相当于35727U。     

棘孢曲霉SM-L22 β-葡萄糖苷酶的纯化与性质*

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

棘孢曲霉SM-L22β-葡萄糖苷酶的纯化与性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

烟曲霉β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

探索获得优良的β-葡萄糖苷酶基因,对实现其工业化生产具有重要意义。烟曲霉Aspergillus fumigatus基因组中含有一个bgl基因(1 752 bp),编码的蛋白约65 kDa,推测为属于糖苷水解酶家族的β-葡萄糖苷酶。将bgl基因克隆并构建了重组表达载体pGEX-bgl,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导获得表达。重组蛋白经亲和层析纯化后,以七叶苷为底物进行了酶学分析,结果表明该酶的最适温度是45℃,最适pH在5.5~6.0之间,对七叶苷的Km值为17.7 mmol/L。该酶在pH 4~7范围内稳定;70℃保温2 h后仍能保持60%的活性。金属离子和化学试剂对酶活性有不同程度的影响,Ca2+对重组酶有轻微的激活作用,而SDS可强烈抑制其活性。由于其相对于真菌来源的其他葡萄糖苷酶稳定性较高,为进一步的研究与应用奠定了基础。     

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。     

嗜热毛壳菌外切葡聚糖纤维二糖水解酶的纯化和部分性质研究

研究液体发酵嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)产生的一种外切葡聚糖纤维二糖水解酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Sephacryl S-100分子筛层析、Q Sepharose Fast Flow强阴离子层析等步骤后获得凝胶电泳均一的外切葡聚糖纤维二糖水解酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得该酶的分子量大小约为66.3kDa和67.1kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为65℃和5.0。在60℃以下酶比较稳定,在70℃酶的半衰期为1h,在80℃下保温20min仍具有20%的活性,该酶的热稳定性较中温真菌的同类酶高,与国外报道的嗜热真菌的同类酶热稳定性接近。以pNPC为底物的Km值为0.956mmol/L。     

绿色木霉耐热β-葡萄糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

旨在对绿色木霉-葡萄糖苷酶进行分离纯化并研究其酶学性质。对绿色木霉GIM3.139进行摇瓶发酵,经离心超滤和Sephadex G-200凝胶层析,得到纯化后的β-葡萄糖苷酶,并研究其酶学性质。结果显示,分离纯化组分经PAGE电泳检测达到电泳纯,研究发现,该酶最适反应温度为80℃,热稳定性好,在70-95℃时能长时间保持较高活力,最适p H值为6.5,耐酸碱稳定性好。金属离子中,Fe3+、Mg2+、K+对β-葡萄糖苷酶的活性起抑制作用,其中Fe3+对该酶的抑制作用最为明显,Fe2+、Mn2+对β-葡萄糖苷酶的活性起激活作用,其中Mn2+对β-葡萄糖苷酶的激活作用最为明显。有机溶剂中,甲醇、丙酮对该酶起到激活作用,其中甲醇的激活作用最明显,而乙酸乙酯对该酶具有明显的抑制作用。分离纯化得到了电泳纯的β-葡萄糖苷酶,并掌握了其基本的酶学性质。     

嗜热毛壳菌内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

探讨了液体发酵嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophile)产生的内切β－葡聚糖酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵分级沉淀,DEAE－Seplharose Fast Flow阴离子层析,Pheny1-Sepha-rose疏水层析,Sephacry1 S-100分子筛层析等步骤便可获得凝胶电泳均一的内切β－葡聚糖酶,经12．5％SDS－PAGE和凝胶过滤层析法分离纯化酶蛋白的分子量约为67．8kD的69．8kD。该酶反应的最适温度和pH分别为60℃和4．0－4．5在pH5.0条件下,该酶在60℃下稳定：70℃保温1h后,仍保留30％的活性;在80摄氏度的半衰期为25min,金属离子内切β－葡聚糖酶的活性影响较大,其中Na^ 对酶有激活作用;Fe^2 ,Ag^ ,Cu^2 ,Ba^2 ,Zn^2 等对酶有抑制作用。该酶对结晶纤维素有没水解能力。     

黑曲霉水解京尼平苷β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

黑曲霉Aspergillus niger发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液依次经过乙醇沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析,获得了两种电泳纯的β-葡萄糖苷酶BGL1和BGL2,它们的相对分子质量分别为102kDa、97kDa,总酶活回收率达到48%。在pH2.5及温度为55℃时,两种BGL水解京尼平苷的速度均达到最大;BGL水解活性受到Na+的激活但不受K+的影响,但Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+和Hg+等离子对BGL活性有不同程度的抑制作用(其中对BGL1的抑制普遍强于BGL2),而且同一种离子对不同BGL活性的影响性质不同,Ca2+显著激活BGL1而对BGL2无影响,Fe3+显著抑制BGL1而激活BGL2。在同样条件下,BGL对对硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷(pNPGlu)、对硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷(pNPGal)和水杨苷均有催化活性,其中对pNPGlu的Km值最小,BGL1、BGL2分别为0.764和1.934mmol/L;而BGL对京尼平苷水解的催化效率最高,BGL1、BGL2的Kcat/Km值分别为4.28×104和1.04×105L/mol·s。BGL1、BGL2活性的pH稳定范围相近,分别为pH2.0-7.0、pH2.0-8.5,但它们的热稳定性差异较大,55℃时BGL2保温60min,酶活保留了60%,而BGL1的酶活半衰期只有10min。     

疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶的纯化及其性质研究

采用硫酸铵沉淀、DEAE SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的疏绵状嗜热丝孢菌 (Thermomyceslanuginosus)几丁质酶。经SDS PAGE和凝胶过滤层析测得纯酶蛋白的分子量在 4 8～ 4 9 .8kD之间。该酶反应的最适温度和最适pH分别为 5 5℃和 4 5 ,在pH4 5条件下 ,该酶在 5 0℃以下稳定 ;6 5℃的半衰期为 2 5min ;70℃保温 2 0min后 ,仍保留 2 4 %的酶活性。其N 端氨基酸序列为AQGYLSVQYFVNWAI。金属离子对几丁质酶的活性影响较大 ,Ca2 、Na 、K 、Ba2 对酶有激活作用 ;Ag 、Fe2 、Cu2 、Hg2 对酶有显著的抑制作用 ;以胶体几丁质为底物的Km 和Vmax值分别为 9 .5 6mg mL和 2 2 . 12 μmol min。抗菌活性显示 ,该酶对供试病原菌有不同程度的抑制作用。     

海枣曲霉β-半乳糖苷酶的提纯与性质

 通过过聚乙二醇6000-磷酸钾缓冲液双相分离、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、羟基磷灰石层析及SephadexG-100凝胶过滤等提纯步骤,从海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)麦麸培养物抽提液中提纯得到凝胶电泳均一的β-半乳糖苷酶。该酶的最适pH为3.5—4.0,最适温度为60℃(反应15分钟),在pH5.0—8.5之间及60℃以下稳定。在65℃和70℃保温时失活50％的时间分别为27和2分钟。用SDS凝胶电泳法和梯度凝胶电泳法分别测得该酶的分子量为115,000和118,000。薄层凝胶等电聚焦法测得其等电点为pH4.6。     

蜗牛酶中一种β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究

通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析的联用从中华白玉蜗牛消化酶中分离出1种具有人参皂苷Rb_1水解活性的β-葡萄糖苷酶.纯化后该酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带.反应最适pH为5.6,最适温度是80 ℃.pH稳定范围很广,在pH为4.0～11.0的溶液中和温度60 ℃以下保持长时间稳定状态,是一个耐碱和中等耐热的糖苷酶.Na~+、K~+、Li~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、EDTA、DTT和SDS不影响该酶活性,而Cu~(2+)、Ag~+和Fe~(3+)对该酶则具有明显的抑制作用.pNPG为底物的动力学参数Km和Vmax分别为0.182 mmol/L和0.189 μmol/(min·mg).     

毁灭柱孢菌中一种人参皂苷Rb1水解酶的纯化及酶学性质研究

通过DEAE-纤维素阴离子交换层析、30％～80％（NH3）2SO3盐析、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析和Mono Q HR5／5阴离子交换层析,从毁灭枉孢菌培养液中部分纯化出一种能够水解人参皂苷Rb,的β-葡萄糖苷酶F-I。F—I具有较好的pH稳定性和热稳定性,在pH4．0～11．0范围内和55℃以下表现出良好的β-葡萄糖苷酶活性,其最适pH为5．0,最适温度为55℃。EDTA、Cu^2＋和Zn^2＋对该酶活性有较强的抑制作用。底物专一性分析表明,F—I能高特异性水解人工合成的底物pNPG,还能水解β-葡萄糖苷键连接的二糖如纤维二糖和龙胆二糖,说明此酶为一种β-葡萄糖苷酶。F—I对人参皂苷Rb1表现了较强的水解活性,而对人参皂苷Rb2和Rc的水解活性较低。该酶水解人参皂苷Rb1的路径为Rb1→Rd→F2→C—K。F—I对人参皂苷Rb1的这种高效水解为稀有人参皂苷的工业制备奠定了基础。     

一株β-葡萄糖苷酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究

【目的】分离获得β-葡萄糖苷酶高产菌株,确定该菌分类地位,并对其所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质进行初步研究。【方法】采用七叶灵显色法从土壤样品中筛选β-葡萄糖苷酶产生菌,再用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)显色法进行复筛;通过形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列相似性分析等方法确定其分类学地位;利用超滤、疏水层析、阴离子层析、分子筛层析法对β-葡萄糖苷酶进行分离纯化;以PNPG为底物,测定β-葡萄糖苷酶的最适反应pH及最适反应温度,通过双倒数作图法确定β-葡萄糖苷酶催化不同底物水解的米氏常数Km值。【结果】从土壤样品中筛选得到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株ZF-6C,初步鉴定为Bacillus korlensis;芽胞杆菌ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶的分子量约为90 kD,最适反应pH和温度分别为7.0和40°C,该酶具有水解β(1,4)糖苷键的活性,最适底物为邻硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷,Km值为0.73 mmol/L。金属离子Ca2+、Pb2+增强酶活,而Cu2+、Fe2+抑制酶活。【结论】首次报道从Bacillus korlensis中分离得到β-葡萄糖苷酶,Bacillus korlensis ZF-6C所产β-葡萄糖苷酶在分子量、最适反应条件及底物特异性等方面均不同于已知酶,可能为一结构新颖且催化效率较高的β-葡萄糖苷酶。     

重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sephadex A\|50离子交换层析、HiPrep16/10 Phenyl疏水作用层析、Superdex200 HR 10/30凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶,比酶活达到15629U/mg。此酶的最适温度为70℃,最适pH70,在60℃保温60min酶活力基本不变,在pH3～8的范围内比较稳定。此酶的Km和Vmax分别为775mmol/L和278mmol\5min\+\{-1\}·mg-1。1mmol/L的Zn2+、Ba2+、Mn2+可使该酶完全失活,KCN、NaN\-3、Na\-2S\-2O\-4、巯基乙醇对酶活力有抑制作用,50mmol/L的EDTA不影响酶活性。     

蓖麻β-半乳糖苷酶的纯化及其基本性质

蓖麻籽黄化苗中存在高活性β-半乳糖苷酶。经硫酸铵分级分离、DEAE-纤维素离子交換层析、Sephadex G-100、CM-Sephadex和DEAE-Sephadex层析纯化。活性收率为6.4％,纯化倍数达107倍。纯化了的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带,SDS-PAGE显示两条蛋白带,其相应分子量分别为3.25×10~4和2.94×10~4。用Sephadex G-200分子筛层析法测得分子量为6.7×10~4。综合上述结果推测该酶是由两个不同的亚基构成。以邻硝基苯酚-β-半乳糖苷为底物测得该酶的表观Km为5.9×10~(-3)mol/L。最适pH和最适温度分别为4.5和50℃。酸碱稳定区域在pH4.6—7.5之间。不同浓度缓冲液以及不同种类缓冲液、不同金属离子对酶活性影响均进行了讨论。     

烟碱脱氢酶的纯化及性质研究

通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等方法对节杆菌(ArthrobacterZ3)所产烟碱脱氢酶进行了纯化,该酶经SDS-PAGE电泳检测为一条带,分子量约为120kDa。该酶活力的最适温度为40℃,在pH5.5-8.0范围内稳定,最适pH约为7.0;对烟碱作用的Km值为7.694×10-4mol/L;Mn2 、Co2 是酶的激活剂,而Cu2 是酶的抑制剂。     

黑曲霉(Aspergillus niger)β-D-葡萄糖苷酶的纯化及其性质

利用垂直板凝胶制备电泳从黑曲霉(Aspergillus niger,AS 3.316)中分离提纯了β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21),经凝胶电泳鉴定为单一带。酶作用的最适pH为4.4,在pH4.0—6.2稳定;最适温度65℃,热稳定性较好,于60℃保温4小时,活力保留80％。此酶作用于纤维二糖的Km值为6.09mM。聚丙烯酰胺薄层等电聚焦测得其pI值为5.5;用SDS凝胶电泳测得其分子量为77000。此酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D-葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。金属离子Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Al~(3+)、Hg~+和Ag~+等对此酶有不同程度的抑制作用,蛋白质侧链修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺对此酶有较强的抑制作用,2-羟基-5-硝基溴苯对酶也有一定的抑制作用,推测色氨酸残基对β-D-葡萄糖苷酶的活力是非常必要的。