人乙型肝炎病毒前表面抗原（preS）基因的突变及其在家蚕细胞中影响 …

为探讨人乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）前表面抗原（ｐｒｅＳ）基因的表达调控机理,以实现高效表达,利用ＰＣＲ方法在克隆的ｐｒｅＳ基因的第２、３位密码子引入同义突变。消除存在于５端编码区保守的反向重复序列,将ｐｒｅＳ基因及其突变形式（ＭｐｒｅＳ）分别重组到转移载体ｐＢＭ０３０,获得ｐＢＭ－ｐｒｅＳ和ｐＢＭ－ＭｐｒｅＳ。将ｐＢＭ－ｐｒｅＳ和ｐＢＭ－ＭｐｒｅＳ分别与野生型家蚕核型多角体病毒（ｂｍＮＰＶ）ＤＮＡ共转     

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原阳性血清中提取病毒DNA,采取PCR技术扩增出前表面抗原(preS)基因片段,重组到质粒载体上,对该基因进行了全序列测定[GenBank索取号CpreS-HZAF325674;preS-LZAF325675].克隆的HBVpreS基因杭州分离物(preS-HZ)和兰州分离物(preS-LZ)全长522个核苷酸,编码174个氨基酸.preS-HZ与已发表的HBVadr亚型上海分离物[8]、北京分离物[9]、日本分离物[5]、HBVadw亚型[10]和ayw亚型[11]preS基因的核苷酸序列同源性分别为96.7%、96.2%、97.3%、88.7%和84.1%,氨基酸序列同源性分别为96.0%、94.9%、97.1%、85.1%和85.4%;preS-LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为96.4%、96.2%、96.9%、88.7%、83.7%,氨基酸序列同源性分别为94.9%、94.9%、96.0%、85.1%、84.1%.分子进化分析(DNASTAR,1999)表明,克隆的两例HBVpreS基因属于adr亚型.preS-LZ与preS-HZ之间有两个核苷酸变异(对应两个氨基酸变异),相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点.在免疫保护区内二者具有较好的保守性,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗.     

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原阳性血清中提取病毒DNA,采取PCR技术扩增出前表面抗原（preS)基因片段,重组到质粒载体上,对该基因进行了全序列测定[GenBank索取号CpreS-HZ:AF 325674;preS-LZ:325675].克隆的HBVpreS基因杭州分离物（preS－HZ）和兰州分离物（preS－LZ）全长522个核苷酸,编码174个氨基酸。preS－HZ与已发表的HBV adr亚型上海分离物、北京分离物、日本分离物、HBVadw亚型和ayw亚型preS基因的核苷酸序列同源性分别为96．7％、96．2％、97．3％、88．7％和84．1％,氨基酸序列同源性分别为96．0％、94．9％、97．1％、85．1％和85．4％;preS－LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为96．4％、96．2％、96．9％、88．7％、83．7％,氨基酸序列同源性分别为94．9％、94．9％、96．0％、85．1％、84．1％,分子进化分析（ADNASTAR,1999）表明,相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点,在免疫保护区内二者具有较好的保守性,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗。     

应用杆状病毒载体在昆虫细胞系统中表达乙型肝炎病毒表面抗原基因

构建了同时带有乙型肝炎病毒表面抗原基因和大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体质粒pVL941lacHBS。应用磷酸钙沉淀技术将pVL941lacHBS DNA转入事先用AcNPV感染过的Sf9细胞,在显色剂X-gal存在下,筛选无多角体的蓝色蚀斑。经过若干次蚀斑纯化,最后获得含乙肝病毒表面抗原基因和β-半乳糖苷酶基因的重组杆状病毒R-AcV941LS。 用R-AcV941LS感染Sf9细胞,在感染后72～96小时,用RPHA和RIA分别检测组织培养上清液和细胞裂解液中的乙型肝炎病毒表面抗原含量。结果,组织培养上清液为3.83μg/1×10~6～2×10~6细胞;细胞裂解液为4.39μg/1×10~6～2×10~6细胞。乙型肝炎病毒表面抗原的合成总量为8.22μg/1×10~6～2×10~6细胞。免疫电镜观察显示表达产物呈约22nm的球形颗粒。小鼠免疫接种实验结果表明,以R-AcV941LS感染Sf9细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原与在哺乳动物细胞系表达的乙型肝炎病毒表面抗原具有相近似的免疫原性。     

乙型肝炎病毒表面抗原preS1在大肠杆菌中的表达与鉴定

本文报告利用pWR590质粒为载体,构建了含1ac启动子、β-半乳糖苷酶(1—590)基因、Xa因子的四肽识别位点和HBV preS1、preS2编码序列的表达质粒,并成功地在大肠杆菌中获得稳定表达。融合蛋白经Xa因子消化和高效液相层析,得到了preS1(1—91)纯肽。此肽特异性地与人肝细胞质膜结合,从而为肝细胞上存在preS1受体提供了直接的实验依据,也为分离和鉴定肝细胞上preS1受体打下了良好的基础。     

乙型肝炎病毒表面抗原preS1在大肠肝菌中的表达与鉴定

本文报告利用ｐＷＲ５９０质粒为载体,构建了含ｌａｃ启动子,β－半乳糖苷酶（１－５９０）基因,Ｘａ因子的四肽识别位点和ＨＢＶ ｐｒｅＳ１,ｐｒｅＳ２编码序列的表达质粒,并成功地大肠杆菌中获得稳定表达。融合蛋白经Ｘａ因子消化和高效液相层析,得到了ｐｒｅＳ１（１－９１）纯肽。此肽特异性地与人肝细胞质膜结合,从而为肝细胞上存在ｐｒｅＳ１受体提供了直接的实验依据,也为分离和鉴定肝细胞上ｐｒｅＳ１受体打下良好     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及其产物活性的初步检测

构建了pSV2DHWS2S质粒,使dhfr扩增基因及乙型肝炎病毒的Pre-S_2+S基因分别在两个SV40早期启动子的调控之下。此质粒转化到CHO-dhfr~-细胞,经克隆、加氨甲喋呤(MTX)筛选、扩增,建立了3个高效分泌HBsAg中蛋白及主蛋白的克隆细胞系。检测了其中的M6细胞系生物学特性。结果表明,免疫电镜下可观察到22nm的颗粒;该细胞用转瓶连续培养60天,每2天收、换液1次,每升HBsAg平均产量为2.9mg。经初步纯化,在SDS-PAGE中显示23k、27k主蛋白带及33k、36k中蛋白带。主蛋白及中蛋白的反相血凝(RPHA)滴度分别为64和128;中蛋白的ELISA滴度为320。部分品系小鼠免疫后能产生滴度为8的抗Pre-S_2抗体。3只家免中仅有1只在免疫后第1、2周可测出Pre-S_2抗体,而3只兔的S抗体滴度都较高,持续时间也较长。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在杆状病毒载体与昆虫细胞体系中的表达

根据杆状病毒A组代表种苜蓿Y纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica Nuclear Po-lyhedrosis Virus,简称AcNPV)的分子生物学资料,我们采用分子剪裁和拼接手段,对AcNPV多角体蛋白基因加以修饰,并用人工合成定位探针,获得大约在该基因的ATG转译起始密码子一9处加有合成BamHl连接序列的转移载体质粒pAc—MV。 再与从乙肝病毒adw亚型的表面抗原基因HBng亚克隆株pYPss一1分出带有Ban·Hl粘性末端的HBsAg基因,构建表达载体质粒pAc—MV—HBsAgo经与野生型AcNPV DNA对Spodoptem 7rugJPerda细胞共转染,借助同源交换,获得插有HBsAg基因的多角体缺陷的重组病毒。根据HBsAg诊断血球凝集试验和HBs^g诊断酶标免疫测定,表明重组病毒使HBsAg基因在昆虫细胞中得到了表达,免疫电镜显示表达产物呈球状颗粒,大小约为22nm。表达产物粗制品按1μg／鼠对bal b／c鼠免疫,并于三周后强化免疫能产生抗体。由HBsAg纯样品酶标免疫法标定的标准曲线估计每升培养物的表达产物约{一8mg,细胞量为1一2×106个/ml.用重组病毒感染玉米螟4龄幼虫,也获得HBsAg基因的表达,展示了简易生产HB sag诊断试剂和疫苗的可喜前景。     

人促红细胞生成素基因在家蚕体中的高效表达

人促红细胞生成素(EPO)是一种调控红系干细胞增殖、分化和成熟的糖蛋白激素。将合成的EPO cDNA插入杆状病毒转移载体pBlueBacⅢ,使其置于Ph基因强启动子控制之下,获得了转移载体pBlueBacEPO。将pBlueBacEPO DNA与野生型BmNPV DNA共转染BmN细胞,经空斑纯化,获插入EPO cDNA的重组病毒rBmNPVEPO。经Sonthern杂交和PCR扩增鉴定证明人EPO基因已正确组建于BmNPV的预定位置。将重组病毒rBmNPVEPO穿刺接种5龄幼虫和蛹,收集感染第3～5d的幼虫血淋巴和3～6.5d蛹血淋巴。用ELISA检测幼虫血淋巴中EPO表达量高达62800u/mL,蛹血淋巴中表达量达74000u/mL。Western blot结果显示幼虫血淋巴和蛹血淋巴均有一条明显的免疫杂交带,分子量均约为26kD。用TF1细胞对幼虫表达产物进行了生物活性测定,每毫升血淋巴中EPO活性约为63000u。     

乙型肝炎病毒3’末端缺失的preS/S基因在转基因小鼠中的表达

从乙型肝炎病毒 ａｄｒ亚型的基因组 ＤＮＡ中分离 ３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的 ＤＮＡ片段,构建了由ＣＭＶ启动子控制的真核表达载体。采用受精卵显微注射方法,获得了基因组整合有３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的２个转基因小鼠品系。在不同的时间点采取血清进行了ＥＬＩＳＡ分析,发现在这２个小鼠品系中３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因可被表达,而且呈稳定状态。此小鼠品系的建立,对于探讨乙型肝炎病毒３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间的关系有重要意义。     

蜕皮激素对家蚕卵黄原蛋白基因表达的调控

蜕皮激素（20-hydroxy ecdysone,20E）是由前胸腺分泌的能调节节肢动物昆虫纲、甲壳纲等动物蜕皮的激素. 家蚕属于完全变态昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育时期. 20E在家蚕发育过程中有不可替代的作用. 本研究通过酶联免疫吸附反应（ELISA）测定家蚕变态期前后血淋巴中20E滴度,发现在卵黄原蛋白基因 (Bombyx mori vitellogenin, BmVg) 高量表达前的雌雄血淋巴中20E含量没有明显差异,但含量变化趋势与BmVg表达趋势相一致. 用20E注射上蔟后60 h的家蚕和添食5龄家蚕, 能诱导雌性和雄性脂肪体中BmVg表达和蛋白合成. 调查处理后的家蚕所产卵中的卵黄磷蛋白（BmVn）含量及重量,发现蚕卵中BmVn含量及蚕卵重量都明显增加|本研究还通过脂肪体体外培养,证明了20E是直接作用于脂肪体来诱导BmVg的表达. 本研究结果表明,20E是通过诱导脂肪体中BmVg的转录来增加蚕卵中BmVn积累,从而最终使得蚕卵重量也相应增加.     

乙型肝炎病毒前S基因区缺失突变发生机制的探讨

检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者和患者外周血内HBV前S区基因缺失突变的分子结构特点,探讨其发生机理.用聚合酶链反应方法从慢性乙肝患者和携带者血清中扩增出前S区基因片段,克隆、测序,分析缺失发生的结构特点,从而推测这些前S区基因缺失突变的产生机制.从262例慢性乙肝患者和103例无症状HBV携带者体内扩增出前S区片段,共在30例患者和携带者中检测出多种前S区基因缺失突变,主要集中于前S1区的3′端和前S2区的5′端.其中有9例患者和携带者体内存在完全一样的nt3019～nt3201 183bp的缺失突变,该缺失突变符合真核细胞mRNA剪接机制,在此位置上各基因型的序列高度保守.同时有另外两种缺失突变,即nt3019～nt3147 129bp缺失、nt3019～nt3109 91bp缺失也符合该剪接机制.有23种缺失突变部分于重复序列之间,符合逆转录过程中的模板转换机制所导致的缺失.根据前基因组RNA预测出二级结构,仅部分缺失突变在RNA二级结构中对应于局部的结构.此结果表明:HBV在外界因素mRNA的剪接机制和内在因素聚合酶蛋白的功能特点的共同作用下,产生各种突变,不同的机制将导致不同类型的缺失突变.除真核细胞mRNA剪接机制外,逆转录过程中的模板转换是主要机制之一.     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

核糖核酸酶抑制蛋白变体RIv在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达

人源的核糖核酸酶抑制蛋白 (ribonucleaseinhibitor,RI)是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质 ,分子量为 5 0kD。从人胚胎肝cDNA文库中克隆到一个核糖核酸酶抑制蛋白RI基因的变体 (ribonucleaseinhibitorvari ant,RIv)。序列分析表明 ,与RI相比较 ,RIv序列中仅有Arg359Ala和Leu36 5Pro两个氨基酸突变 ,而核苷酸同源性较低 ,为 78%。将RIv克隆于pET2 8a( ) ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,利用 6×His亲和层析柱纯化得到了His RIv重组蛋白。将RIv克隆于转移载体pBacPAK8,利用家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)表达系统表达得到重组RIv。体外活性测定实验表明 ,重组RIv具有抑制牛胰RNaseA酶解 2 8S和 18SrRNA的作用。     

宫内感染中HBV前S/S区基因种系进化树及变异特点的研究

目的:通过HBV前S/S区基因变异研究探讨HBV宫内感染的机制。方法:将HBsAg阳性母亲按照随访其新生儿是否发生宫内感染,分为病例组和对照组,经PCR扩增HBV DNA,基因克隆、测序,构建种系进化树分析前S/S基因的突变。结果:共得到60株HBV序列,来源于同一组的序列较为集中在树中的某枝,而且进化距离从病例组母亲、病例组患儿到对照组母亲存在由近及远的特征。结论:各组病毒株在基因序列进化上存在差异,某些突变位点在非宫内感染组母亲中的发生率较高,突变的发生可能使其所在的编码区功能发生变化而影响宫内感染的发生。     

新霉素抗性基因在家蚕中的插入和表达

构建含新霉素抗性基因（ｎｅｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ,ｎｅｏＲ）的重组质粒ｐＦＮ,经ＨｉｎｄＩＩ酶切后,用基因枪将ＤＮＡ片段导入家蚕早期受精卵中（Ｇ０代）。孵化的Ｇ１、Ｇ２代蚁蚕均经含新霉素的人工饲料添食２４ｈ后,筛选出新霉素抗性的个体（能正常生长发育的）改为桑叶饲养。于Ｇ２代的５龄第二天从后部丝腺抽提总ＤＮＡ,再以ｎｅｏＲ的ｃＤＮＡ为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测。结果表明ｎｅｏＲ基因已转入家蚕ＤＮＡ中,获得了含ｎｅｏＲ的转基因蚕。     

家蚕Bms3a基因真核表达载体的构建及其在家蚕细胞和蚕体中的表达

Bms3a基因可能在家蚕Bombyx mori抗病或细胞凋亡中有一定的作用。将融合有绿色荧光蛋白的Bins3a基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中获得了pFastBac-IE1-Bms3a-EGFP真核表达载体,利用杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,以重组病毒感染家蚕BmN细胞和五龄幼虫,分别在感染24h和48h检测到有绿色荧光蛋白的表达,Western blot证明表达的融合蛋白在相对分子量约57kD处出现特异条带,与预计的蛋白理论值相符。结果表明BmS3A-EGFP融合蛋白在家蚕细胞BmN及幼虫体中得到高效表达。研究结果为进一步研究BmS3A蛋白的功能奠定了基础。