一个α,β地中海贫血复合家系β珠蛋白基因的进一步研究

 前文~[1]曾报道广西一个α,β地中海贫血复合家系的血红蛋白组成及α珠蛋白基因分析结果,并讨论了各成员可能的β珠蛋白基因结构情况。本文利用先进的PCR即基因扩增技术,结合特异寡核苷酸探针斑点杂交及扩增后直接测定DNA序列的技术,进一步研究并彻底搞请了该家系各成员的β珠蛋白基因结构情况。结果显示:母亲及两个弟弟都是编码子41—42TTCT四个碱基缺失造成框架位移所致β地中海贫血的杂合子。父亲与先证者的β基因均属正常。前三个成员均为α地贫复合β地贫,其α与β珠蛋白链合成的不均衡状态得到改善,贫血症状也明显轻。     

β地中海贫血基因治疗的研究进展

基因治疗是根治β地中海贫血研究的重点方向。位点控制（LCR）的发现以及新型基因转移系统不断开发研制,结导入正常β珠蛋白基因以实现基因治疗的设想带来了希望但同时也产生了新课题;与此同时,分别从DNA和RNA水平对受损的β珠蛋白基因进行修正治疗的研究也在开展当中。随着珠蛋白基因表达调控机制研究不断深入,同时开发出安全高效的新型病毒载体,有可能最终实现β地中海贫血基因治疗。     

非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳在珠蛋白链的分离及地中海贫血研究中的应用

首次应用非连续聚丙烯酰胺凝胶(12％和7.5％)电泳将胚胎、胎儿及成人溶血液中各种正常珠蛋白链分离。其电泳移动顺序为:α、β、Gγ、δ、Aδ、ε和ζ链,δ与Gγ链得到较好的分离。10例β—地中海贫血杂合子血样的δ链光密扫描测定结果为2.62±0.76％。重型β—地中海贫血患者的Gγ与Aγ比1.09～1.27,各类样品的α/非α链含量比约为1。结合网织红细胞体外培育,~3H—亮氨酸标记新合成的珠蛋白链,以放射性荧光自显影技术测定了五例α—地贫患者的珠蛋白链合成速率,其α/β合成比均小于1(0.79～0.89),而正常对照为0.97。在珠蛋白链的研究中,该方法具有简单、灵敏等优点。     

应用实时定量RT-PCR技术检测b地中海贫血 珠蛋白基因的表达

为了定量检测 b 地中海贫血(b 地贫)的 a、b 和γ珠蛋白基因表达水平, 提取正常成人对照组、正常胎儿对照组和b 地贫患者组组成的样本 DNA,采用反向点杂交法（RDB）分析b 地贫各种突变类型;提取样本RNA用于进行针对a、b 和γ珠蛋白基因的荧光实时定量RT-PCR（FQ RT-PCR）。根据FQ RT-PCR原理,设计合成分别对应于a、b 和γ珠蛋白基因的3对引物和3条荧光探针,FQ RT-PCR在ABI 7700系统进行。用SPSS 10.0对实验数据进行统计学分析,分别计算正常对照组 (bA/bA,aa/aa),脐带血组(bA/bA,aa/aa),轻型b 地贫组(bT/bA,aa/aa),重型b地贫组(bT/bT,aa/aa)的a、b 和γmRNA比值,其中a/b分别为4.62±1.20、7.81±2.89、13.51±5.12、188.24±374.04;a/(b +γ)分别为4.43±1.17、0.56±0.49、9.62±4.37、2.14±1.58;γ/(b+γ) 分别为0.04±0.03、0.92±0.06、0.28±0.18、0.95±0.04。由于组与组之间均值变异范围较大,将其进行对数转换后再进行方差分析。结果表明： a/b与a/(b+γ)在所有组与组之间均有显著性差异。γ/(b+γ)除了在脐带血组和重型b地贫组之间无显著性差异外,在其他组与组之间均有显著性差异。实验说明,人类b珠蛋白基因的表达水平从正常对照组到重型b地贫组急剧下降且以重型b地贫组为最低;相反γ珠蛋白基因表达却明显升高,以重型b地贫组为最高。与正常成人对照组相比,胎儿期b mRNA水平较低但γmRNA 水平较高。因此,正常个体不同时期和不同类型b 地贫之间a、b与γ珠蛋白基因表达不同而且互相影响。 Abstract：whole blood samples were collected from 100 normal healthy adults, from umbilical cord of 33 newborn infants, 111 individuals with b-thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and 39 with b-thalassemia major (bT/bT,aa/aa). Prior to quantitative analysis of globin gene expression, DNA was extracted from all blood samples and used for b-thalassemia genotype analysis. Different types of b globin gene mutations were analyzed using reverse dot blotting (RDB) method. Total RNA were extracted and subjected to real-time RT-PCR for quantitative measurement of a, b andγglobin mRNA using three sets of primers and fluorescent-labeled probes, designed according to the sequences of a, b andγhuman globin gene. Real-time RT-PCR was performed in ABI 7700 system. Following the real-time RT-PCR, the mean values of a, b andγglobin mRNA were calculated and the ratios of a/b, a/(b + γ) andγ/(b + γ) were determined to characterize the relative expression levels of different globin genes among normal adult, infant, b-thalassemia minor and b-thalassemia major patients. The resultant data were analyzed using SPSS 10.0 software to determine statistical significance of human globin gene expression among normal controls and b-thalassemia patients. Due to vast variations of the mean globin gene mRNA levels among different groups, log conversion of a/b + 1, a/(b + γ) + 1 andγ/(b + γ) +1 was used for statistical analyses and intergroup comparison. The a/b globin gene mRNA ratios were determined to be 4.62±1.20, 7.81±2.89, 13.51±5.12, and 188.24±374.04 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b-thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. The a/(b+γ) ratios were 4.43±1.17, 0.56±0.49, 9.62±4.37, and 2.14±1.58 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b- thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. Theγ/(b+γ) ratios were 0.04±0.03, 0.92±0.06, 0.28±0.18, and 0.95±0.04 for normal healthy adult (bA/bA,aa/aa), infant (bA/bA,aa/aa), b- thalassemia minor (bT/bA,aa/aa) and b- thalassemia major(bT/bT,aa/aa) respectively. Following statistical analyses, the a/b and a/(b+γ) globin gene mRNA ratios were significantly different among four different groups (normal adult, normal infant, b- thalassemia minor and b- thalassemia major). The γ/(b + γ) globin gene mRNA ratio was significantly different among all groups except for between infant and b- thalassemia major patients. Human b globin gene mRNA levels decrease progressively and dramatically from normal adults to b-thalassemia patients with b-thalassemia major having the lowest levels. On the other hand, the γglobin gene mRNA levels increase progressively from normal adult to b-thalassemia patients with b-thalassemia major having the highest levels. Infants have relatively lower levels of b but higher levels of γglobin gene mRNA as compared to those in normal adults. Thus, the relative expression levels of a, b or γglobin genes varied but inter-related among different ages of normal individuals and different b-thalassemia genotypes.     

中国人β—珠蛋白基因—530基序的变异性研究

应用双链ＤＮＡ循环则序法,对中国人群２０例血液学正体个体,７７例β－珠蛋白合成异常患者（４３例）及其部分亲属（３４例）的β珠蛋基因上游－５３０基序进行了序列分析。结果表明,中国人－５３０基序存在（ＡＴ）８Ｔ５,（ＡＴ）７Ｔ７和（ＡＴ）９Ｔ５三种主要的重排类型,以及一种未见报道的稀有重排类型（ＡＴ）１０Ｔ３。进一步经家系连锁分析,获得由β珠蛋白结构基因与－５３０基序重排组成的单体型,结果显示ＩＶＳ－     

人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法

目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。     

中国人α珠蛋白基因-α3.7缺失亚型的研究

-α3.7是中国人常见的缺失型α-地中海贫血-2。根据重组位点的不同,-α3.7可分为-α3.7Ⅰ型、-α3.7Ⅱ型和-α3.7Ⅲ型,并且亚型的种类和频率具有种族差异性。本研究在中国人群中用PCR基因分析方法检出具有α珠蛋白基因-α3.7缺失的患者56例,然后用ApalⅠ和BalⅠ限制性内切酶进行分型。 结果表明,在这56例具有-α3.7缺失的患者中,有54例是-α3.7Ⅰ型,有2例是-α3.7Ⅱ型,尚未发现-α3.7Ⅲ型。此结果丰富了我国α地贫基因型谱的资料。 Abstract:-α3.7 is a common deletional α-thalassemia-2 in China.According to different recombination sites,-α3.7 can be divided into -α3.7Ⅰ、-α3.7Ⅱand -α3.7Ⅲ.The frequency and population distribution of these -α3.7 are quite different.In this study,we detected 56 patients among Chinese population of -α3.7 defect in alpha globin gene by PCR method,then the PCR product was digested by the restriction enzyme ApalⅠand BalⅠ.The sub-typing result shows that in the 56 cases of -α3.7 defect,54 out of 56 is -α3.7Ⅰ,2 out of 56 is -α3.7Ⅱ and none of -α3.7Ⅲ is detected.This result enriches the data about the alpha thalassemia genotypes of Chinese people.     

大黄鱼紧密连锁的α-和β-珠蛋白基因间序列功能分析

石首鱼类属鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Percoidei）、石首鱼科（Sciaenidae）。它们是一群较暖水性鱼类,分布范围广泛。由于中国大陆架面积非常广大,为一浅海盆地,且多为泥沙底质,环境很适合石首鱼类的生长,故种类繁多,有13属37种,居世界首位。但多年来的狂捞滥捕加上外部生态环境的恶化,导致中国近海的许多石首鱼类野生资源枯竭,因此南部沿海许多地区开展了石首鱼类的人工养殖。大黄鱼、黄姑鱼、双棘黄姑鱼、美国红鱼都是我国沿海重要人工养殖石首鱼类。     

非缺失型α地中海贫血基因的克隆化分离

从一例基因型为αα~T/—的血红蛋白H病患者的手术切除脾制备了染色体DNA,用BamHⅠ水解后,回收14±1kb的DNA片段,作为插入体。以λEMBL_4噬菌体经非超离心法制备基因组DNA作为替换载体。经BamHⅠ水解回收左右臂,与α地贫脾DNA 14kb片段连接,包装、传染后,得10~4—10~5重组噬菌体/μg。以人α珠蛋白基因特异的探针作Benton原位杂交,M4×10~3克隆中筛出两个含α珠蛋白基因序列的克隆株。其中一株扩增后制备的重组DNA经酶解图谱及Southern印迹杂交鉴定,中间可替换部分含有14kb的人α珠蛋白基因组DNA。从而在我国首次从中国地贫病人中,以基因工程的方法,分离了克隆化的非缺失型α地贫基因,为研究其结构与功能打下了重要基础。     

基因编辑技术在β-地中海贫血治疗中的研究

β-地中海贫血(β-地贫)是一种全球性的单基因遗传病,目前针对该病的治疗方法除造血干细胞移植外都是对症治疗,无法达到根治效果。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病,达到根治疾病的目的。近年,随着基因编辑技术的发展,基因治疗越来越成熟完善,在β-地贫治疗中的应用也变得广泛。目前,基因编辑技术发展经历了4个阶段,分别为ZFN技术、TALEN技术、CRISPR/Cas9技术以及单碱基编辑技术。本综述将总结上述4种基因编辑技术在β-地贫治疗中的原理、研究、优缺点以及局限性,旨在优化β-地贫的治疗策略。     

人胎儿γ-珠蛋白基因的再活化及在β血红蛋白病治疗中的

在个体发育过程中,人β类珠蛋白基因的表达存在从胎儿（γ）到成人（β）珠蛋白基因的表达转换（或称开关）.β-地中海贫血和镰刀型贫血症是两种最为常见的严重危害人类健康的单基因遗传病,通过诱导胎儿期血红蛋白（HbF,α2γ2）在成人期表达对该病的治疗是一种有效的策略.一些活化γ珠蛋白基因表达的转录因子和辅助因子已经被鉴定,一些可以增加胎儿血红蛋白在成人红细胞中表达的药物也已被鉴别和实验,它们的作用机制被部分揭示,这些研究为发展通过活化γ-珠蛋白基因治疗镰刀形细胞贫血和重型β-地中海贫血的方法提供了重要线索和实验依据.     

用错配PCR技术检测中国人β-地中海贫血基因突变

β-地中海贫血(β-地贫)的分子基础主要为点突变,目前中国β-地贫人群中已发现16种点突变。我们在基因频率调查的基础上,发现我国南方95％以上的β-地贫由5种点突变所致,它们是:codon 41-42(-CTTT)缺失突变,IVS-2 nt 654(C→T)突变,codon 17     

一个黎族α-地中海贫血融合基因遗传家系的鉴定

鉴定海南黎族人群中发现的一种α-地中海贫血融合基因,并对其家系进行分析,探讨融合基因形成机制及遗传规律。采集先证者及其家系成员外周全血,进行血细胞分析、血红蛋白电泳和地贫常见基因型检测,并采用Gap-PCR法结合特异引物和基因测序技术对先证者基因型进行鉴定。结果显示先证者基因型为Fusion gene/-α4.2,且该融合基因是由于α珠蛋白基因的α2段与Ψα1段序列发生融合所致。家系遗传分析显示,其祖父基因型为Fusion gene/αα,伯父和父亲的基因型均为Fusion gene/-α4.2,母亲基因型为-α4.2/αwsαws,弟弟基因型为-α4.2/αwsαws。海南省黎族人群中存在有α-地贫融合基因,该发现丰富了黎族地贫基因突变数据库,对遗传咨询及地贫基因诊断和防治具有重要意义。     

高原世居藏族α、β珠蛋白编码基因的克隆与测序

目的:通过对高原世居藏族α、β珠蛋白编码基因的分析,探讨藏族Hb高氧亲合力的分子机制.方法:高原现场采集健康成年男性藏族人骨髓样品,提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得人α和β珠蛋白的cDNA,与PGEM-T Easy质粒连接后,将α和β珠蛋白的cDNA转化JM109大肠杆菌中扩增培养,经酶切鉴定后测序,结果与NCBI数据库进行同源性比较.结果:藏族人α珠蛋白的cDNA与NCBI数据库登录的人cDNA序列相同,没有突变位点.一例藏族人β珠蛋白143位密码子发生了氧亲和力增高的碱基突变(CAC-＞CGC),其对应的氨基酸由His变为Arg(即Hb Abruzzo).结论:藏族人高氧亲和力变种的发现,为今后高原低氧适应相关基因的研究提供了线索.     

人体β—珠蛋白基因5‘旁侧调控元件与不同发育时期调控因子的…

人β－珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肟和Ｋ５６２细胞中则处于关闭状态,凝胶电泳阻抑法分析发现,在人和肝,成年肝及Ｋ５６２细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件（－３７２到－１９４ｂｐ）相结合的红系组织特生的调控因子。竞争试验的结果表明,成年肝和Ｋ５６２细胞中的调控因子与β－珠蛋白基因５旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相惟性,这两各细胞的调控因子既结合     

海口地区89例α-地中海贫血基因型的研究

为了探讨海口地区α-地中海贫血的基因型和发病情况,作者采用聚合酶链反应(polymerase chain re-action,PCR)技术进行α-地中海贫血基因分型的检测.结果显示,海口地区319例疑诊患者共检出α-地中海贫血为89例,阳性率达27.90%,共检出8种基因型:--SEA/αα(33例)、-α3.7/αα(18例)、-α3.7/-α3.7(3例)、-α4.2/αα(21例)、-α4.2/-α4.2(6例)、-α3.7/-α4.2(5例)、-α3.7/--SEA(1例)和-α4.2/--SEA(2例),以--SEA/αα东南亚缺失型为主.说明海口地区α-地中海贫血发生率较高,应加强地中海贫血的婚前、产前筛查和产前基因诊断等工作,以杜绝重型α-地中海贫血患儿的出生.