转基因红鲤体细胞的核移植

以F4代转hGH基因红鲤体细胞（肾脏和尾鳍）及培养18代的F4代转hGH基因红鲤尾鳍细胞为核供体,泥鳅或黄河鲤成熟卵为受体,进行了核移植,以探讨外源F4代转基因鱼体外源基因的分布与存在形式,稳定性和克隆转基因鱼的可能性。F4代红鲁肾脏细胞核与泥鳅卵配合的核移植胚胎有12．4％发育到囊胚,0．33％发育到神经胚;F4代尾鳍细胞核移入泥鳅卵后的重组胚发育到囊胚,神经胚、肌节期和肌肉效应期的胚胎分别为24．5％、0．3％、0．2％和0．1％;对照卵无发育。F4代红鲤尾鳍培养细胞与黄河鲤卵子配合的重组胚胎有50．53％发育到囊胚,5．69％发育到原肠胚,0．53％发育到神经胚,0．4％发育到肌节期。说明由于同种细胞核与卵细胞的相容性高于异种核卵的相容性,早期发育率高;而由于培养细胞的异倍化,后期的发育率降低。用PCR技术对供体鱼不同个体及同一体不同组织外源基因检测,结果100％个体为阳性鱼,而且不同组织的阳性率也是100％,说明外源基因均匀分布在不同组织中。无论F4代转基因鱼的肾脏细胞、尾鳍细胞还是培养的尾鳍细胞作核移植供体,核移植胚胎中hGH基因的检出率为100％。说明F4代转基因红鲤个体不同细胞都存在hGH基因,而且经长期培养不会丢失。表明F4代转基因红鲤中的外源hGH基因已基本稳定,体细胞核移植可以作为获得同质化转基因鱼的有效手段,但核移植效率还很低。另外还讨论了核质的相容性、细胞周期的协调、染色体的变异等因素对核移植的影响。     

转hDAF基因小鼠的构建(英文)

本工作构建了含有ｈＤＡＦ基因的转基因小鼠,以便研究ｈＤＡＦ基因能否消除异种器官移植中的排斥反应。 采用ＤＮＡ重组的方法构建ｈＤＡＦ基因的表达载体ｐＳＰ６４ＨＰ（Ｆｉｇ．１）。通过受精卵显微注射,将其中的目的基因片段,转移到小鼠体内,建立转基因小鼠。再通过Ｄｏｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ杂交方法对出生小鼠的基因组特征进行查证。 连续两次对直接裂解菌液做ＰＣＲ扩增,筛选出重组质粒（Ｆｉｇ．２＆３）,酶切图谱（Ｆｉｇ．４）和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（Ｆｉｇ．５）分析结果与预期吻合,出现预期条带;小鼠受精卵注射后存活比率为７７．９％,受精卵的发育率为３．４％,出生小鼠中,１０．５％出现清晰杂交信号。 表明：ｈＤＡＦ基因表达载体构建成功;并整合入小鼠基因组中。     

PCR扩增同源重组片段筛选转基因胚胎

使用小鼠乳清酸蛋白基因（ＷＡＰ）启动子控制下的人集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因为显微注射片段,采用ＰＣＲ方法检测了转基因胚,为消除ＰＣＲ扩增中的假阳性结果,构建了两个具有部分同源性的亚克隆片段进行共注射．ＰＣＲ扩增片段跨越这一同源区域,仅当注射的片段能够整合并发生正常重组,转基因整合胚才能以相对高的比例扩增出特异性片段．结果表明,１、２和８细胞期的阳性率分别为１１．１％、５５．５％和４４．４％,较常规ＰＣＲ检测获得更为明确的结论,为在大动物转基因胚胎检测提供了依据     

兔受精卵显微注射外源基因后体外培养的卵裂发育

从超数排卵的１４只母兔获得４３８枚受精卵,卵龄１６～２２小时．显微操作在带微分干涉和相差的Ｎｉｋｏｎ倒置显微镜下进行．注射针的尖端外也０．５μｍ,离尖端４０和８０μｍ处的外径分别为４．２和６．５μｍ．注射用外源基因是绵羊生长激素基因与ＭＴ－１启动基因藕连的线状ＤＮＡ溶液（１ｎｇ／μｌ）．１４０枚注射的受精卵和未注射的１４５枚受精卵（对照）,在Ｈａｍ’ｓＦ—１０培养液（补充生长因子）中培养（３８℃,５％的ＣＯ２）．结果,培养４８小时后,注射组卵裂发育率分别是：未卵裂７．９％（１１／１４０）、卵裂至２～４细胞期１１．０％（１６／１４０）、卵裂至８～１６细胞期８０．７％（１１３／１４０）．对照组相应的卵裂率分别是４．１％（６／１４５）、１２．４％（１８／１４５）和８３．４％（１２１／１４５）．两组卵裂发育率相近．本实验的显微操作对注射后卵的发育没有产生明显的伤害影响．     

获得高质量受精卵进行转基因

在转基因小鼠的建立过程中,获得高质量的受精卵是进行外源基因微注射和受精卵植物的关键一步。本研究中通过对获得的资料做统计学处理,建立了预测受精卵数量和质量的回归方程。对获得的受精卵进行了培养和微注射,为有效建立转基因鼠提供依据。     

胚胎发育早期转基因整合的研究

转基因动物的建立是一项复杂而艰苦的工作,在转基因胚移植受体前对其进行检测,无疑对转基因动物建立具有重要意义。使用小鼠乳清酸蛋白（WAP）控制下的人粒细胞激落刺激因子（G-CSF）基因为显微注射片段,采用PCR方法检测了转基因胚,在1、2和8细胞期的阳性率为100％、77．7％和44．4％。为消除PCR扩增中的假阳性结果,构建了两个具有部分同源性的亚克隆片段进行共注射。PCR扩增片段跨越这一同源区域,转基因的非整合胚不能扩增出特异性片段。结果表明,1、2和8细胞期的阳性率分别为11．1％、55．5％和44．4％,较常规PCR检测获得更为明确的结论,为在大动物转基因的检测提供了新依据。     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用．本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪．将sFat—1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植．先后移植了1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠（90％）,7头妊娠足月（70％）分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1．1％（出生仔猪／移植胚胎）．体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响．当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率（100％）,而排卵后移植妊娠足月率为0％．对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87％．RT—PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat—1基因．以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFat-1基因的克隆猪．     

斑马鱼两种转基因方法的比较

对斑马鱼(Danio rerio)的两种转基因方法进行比较,分别采用显微注射和电脉冲导入法将携带有GFP报告基因的表达载体质粒导入斑马鱼受精卵,得出电脉冲最佳导入条件为最适电压125 V/cm,电阻50 Ω,最佳导入时期为1-2细胞期(40-50 min),以及最佳外源基因浓度为300 ng/μL.利用两种方法均得到转GFP基因的斑马鱼,而两种方法对比的结果表明,显微注射法耗时费力,但转基因阳性率高;电脉冲法一次可以处理大批量受精卵,但转基因阳性率远低于显微注射法.     

表达人α-1，2-岩藻糖苷转移酶、衰变加速因子和CD59基因的转基因小鼠的建立及其抗异种移植排斥反应的研究

在进行非协调性异种器官移植时,目前已经证实表达人α-1,2-岩藻糖苷转移酶（HT）或者补体调节蛋白的供体动物器官均可以部分克服超急性排斥反应．本文的研究目的是探讨是否共表达人HT和补体调节蛋白（衰变加速因子与CD59）的转基因小鼠的外周血单核细胞能更有效的克服异种移植排斥反应．利用受精卵显微注射技术建立转人HT,DAF和／或CD59基因的小鼠动物模型,流式细胞技术筛选表达不同基因的转基因小鼠．将小鼠的外周血单核细胞与15％的人血清共孵育,检测细胞表面天然抗体的沉积、补体的激活以及黏附分子的表达等．三种目的基因均可以在转基因小鼠体内表达,并且HT基因的表达显著减少了引起异种移植排斥反应的主要抗原半乳糖α-1,3-半乳糖（α—Gal）的表达．功能实验表明,与单一目的基因表达的转基因小鼠相比,共表达HT／DAF或HT／CD59的转基因小鼠的外周血单核细胞对抗人血清介导溶破细胞的能力显著增强．而且三基因共表达的外周血单核细胞对抗人血清介导溶破细胞的能力最强,可以克服超急性排斥反应并且可以减少黏附分子的表达．高水平表达人HT,DAF和CD59基因的转基因小鼠可以完全克服异种器官移植超急性排斥反应并且可以部分克服急性血管排斥反应．本研究表明,表达三种基因的转基因小鼠的器官异种移植时存活时间可以显著延长,对异种移植来说也许是更合适的选择．     

整合人mAAT基因转基因山羊的获得

旨在通过动物转基因技术开发奶山羊的乳腺生产治疗人肺纤维性囊肿的新药－人抗胰蛋白酶因子（人mAAT),选择繁殖机能优良的奶山羊56只作为供体,采用FSH＋LH做超数排卵,获取原核期胚,并进行显微注射和鲜胚移植,3月和5月两个月份超排处理后超排效果明显好于12月份,分别可获得平均排卵19．50,21．70和16．06枚,受精卵精分别为4．31,6．48和3．57枚,显微注射后胚胎移植给供体或自然发情的受体,移植受胎率分别为18．18％和25．00％,所生羔羊29只,对转入外外基因编码区N－末端和3‘调控区部分序列进行PCR,PCR-Southem和Southern检测,检出阳性转基因羊羔4只,基因的融合效率为13．79％。     

龙须草无融合生殖的胚胎学证据

采用石蜡切片技术对龙须草(Eulaliopsisbinata(Rotz)C.E.Hubb)进行了系统的胚胎学研究,证明龙须草为禾本科植物中一种新的无融合生殖材料。龙须草无融合生殖方式为无孢子生殖,在胚珠发育早期,多个珠心细胞特化为无孢子生殖原始细胞,由原始细胞发育为单核胚囊,经两次有丝分裂形成4核胚囊,进一步分化形成两种类型的成熟胚囊:(1)具1个卵细胞,1个助细胞和2个极核,占观察总数的67.6%;(2)具1个卵细胞,2个助细胞和1个极核,占观察总数的32.4%。胚囊发育属大黍型。多个无孢子生殖原始细胞可以同时发育,最后形成2个或多个胚囊,其比例为17.7%。胚珠内没有有性胚囊的发育。胚的发生有两种类型:(1)早发生胚(74%),开花前1~2d,极核未分裂前卵细胞分裂形成胚;(2)迟发生胚(26%),开花后2~3d,极核分裂形成多个胚乳游离核后,卵细胞启动分裂形成胚。存在多胚现象,多胚来自不同胚囊内卵细胞的孤雌生殖,多胚发生率为13%。胚乳由极核不经受精自发分裂产生。     

四倍体大燕麦与六倍体裸燕麦的受精作用和胚胎发育

用石蜡切片法,对四倍体大燕麦（Avena magna L.）和六倍体裸燕麦（Avena nuda L.）杂交的受精作用和胚胎发育进行了观察。结果表明,六倍体裸燕麦花偻在四倍体大燕麦柱头上萌发良好,花粉管可顺利长入花柱和胚囊,观察的168个四倍体大燕麦子房中,2.38%发生了双受精,产生了胚和胚乳;1.79%发生了单卵受精,只产生胚乳而无胚;总受精率为5.36%;成胚率为4.17%。由于胚乳的缺管或发育异常及败育,最终难以获得有生活力的种子,为四倍体大燕麦和六倍体裸燕麦杂交提供了细胞胚胎学证据。     

龙须草无融合生殖的胚胎学证据

采用石蜡切片技术对龙须草(Eulaliopsis binata(Rotz)C.E.Hubb)进行了系统的胚胎学研究,证明龙须草为禾本科植物中一种新的无融合生殖材料.龙须草无融合生殖方式为无孢子生殖,在胚珠发育早期,多个珠心细胞特化为无孢子生殖原始细胞,由原始细胞发育为单核胚囊,经两次有丝分裂形成4核胚囊,进一步分化形成两种类型的成熟胚囊:(1)具1个卵细胞,1个助细胞和2个极核,占观察总数的67.6%;(2)具1个卵细胞,2个助细胞和1个极核,占观察总数的32.4%.胚囊发育属大黍型.多个无孢子生殖原始细胞可以同时发育,最后形成2个或多个胚囊,其比例为17.7%.胚珠内没有有性胚囊的发育.胚的发生有两种类型:(1)早发生胚(74%),开花前1～2 d,极核未分裂前卵细胞分裂形成胚;(2)迟发生胚(26%),开花后2～3 d,极核分裂形成多个胚乳游离核后,卵细胞启动分裂形成胚.存在多胚现象,多胚来自不同胚囊内卵细胞的孤雌生殖,多胚发生率为13%.胚乳由极核不经受精自发分裂产生.     

四倍体大燕麦与六倍体裸燕麦的受精作用和胚胎发育

用石蜡切片法,对四倍体大燕麦(Avena magna L.)和六倍体裸燕麦(Avena nuda L.)杂交的受精作用和胚胎发育进行了观察。结果表明,六倍体裸燕麦花粉在四倍体大燕麦柱头上萌发良好,花粉管可顺利长入花柱和胚囊。观察的168个四倍体大燕麦子房中,238%发生了双受精,产生了胚和胚乳;179%发生了单卵受精,只产生胚乳而无胚;总受精率为536%;成胚率为417%。由于胚乳的缺乏或发育异常及败育,最终难以获得有生活力的种子。为四倍体大燕麦和六倍体裸燕麦杂交提供了细胞胚胎学证据。     

管氏肿腿蜂的胚胎发育观察

管氏肿腿蜂Scleroderma guani Xiao et Wu的卵在24℃和RH60%~70%条件下发育约140h孵化。根据胚胎外形的发育特点,可将整个发育过程可分5个阶段:早期发育阶段、胚胎伸长期、原躯原头分化阶段、器官形成阶段和胚胎成熟期。胚层形成趋于简单化,未形成解剖学上比较完整的呼吸、排泄及循环等系统。口道形成后,胚胎体积逐渐增加,这表明胚胎在发育过程中吸收了寄主的营养物质。     

硬粒小麦与珍珠栗远缘杂交的受精作用和胚胎发育

对硬粒小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｎｄｕｒｕｍＤｅｓｆ．）和珍珠栗（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍｇｌａｕｃｕｍｓｙｎ．Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ）远缘杂交的受精作用和胚胎发育进行了研究。对授粉后的１９２个硬粒小麦子房进行制片观察,７．８１％发生双受精,具胚和胚乳,但胚乳发育往往落后于胚的发育;３．１３％只发生了单卵受精,只产生胚而无胚乳;１．０４％发生了单极核受精,只产生胚乳而无胚。总受精率为１１．９８％,成胚率为１０．９４％。由于胚乳的缺乏或发育异常及败育,最终难以获得有生活力的种子     

硬粒小麦与珍珠栗远缘杂交的受精作用和胚胎发育

对硬粒小麦(Triticum durum Desf.)和珍珠栗(Pennisetum glaucum syn.P. americanum)远缘杂交的受精作用和胚胎发育进行了研究。对授粉后的192个硬粒小麦子房进行制片观察,7.81％发生双受精,具胚和胚乳,但胚乳发育往往落后于胚的发育;3.13％只发生了单卵受精,只产生胚而无胚乳;1.04％发生了单极核受精,只产生胚乳而无胚。总受精率为11.98％,成胚率为10.94％。由于胚乳的缺乏或发育异常及败育,最终难以获得有生活力的种子。     

自分泌生长因子对早期胚胎体外发育的影响（简报）

Two-cell-stage embryos were flushed from the oviducts on Day 2. Zygotes were collected from oviducts on Day 1 (Fertilization In Situ, ISF) or derived from fertilization in vitro (IVF). 2-cell embryos had a high rate of blastocyst development to each embryo concentration from 1 embryo/microliter to 1 embryo/1000 microliters. The zygotes produced by either ISF or IVF were adversely affected by reducing the embryo concentration over this range (P < 0.001), with approximately 82.5% of ISF zygotes developing to blastocysts at highest concentration but only 22.3% at the lowest. For IVF zygotes the corresponding results were 46.3% and 5.2%. The number of cells in each blastocyst from 2-cell embryos was significantly higher than that from ISF and IVF group. The media supplementing Platelet-activating factor (PAF) caused a significant increase in the rate of blastocyst development of IVF zygotes at embryo concentration of 1 embryo/10 microliters (10 ng/ml) and 1 embryo/100 microliters (100 ng/ml). Insulin-like growth factor (IGF) (10 ng/ml) also stimulated development of IVF zygotes when they were cultured at the concentration of 1 embryo/10 microliters. Epidermal growth factor (EGF) was no effect over range of 1-1000 ng/ml to embryo development. The results show that factors necessary for normal embryo development are diluted to suboptimal levels during culture at low embryo concentration. The PAF, IGF-I partially compensate the effects of low embryo concentration during culture and play important roles as autocrine embryotrophic factors.     

小麦与赖草远缘杂交的受精和胚胎发育

对小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）和赖草（Ｌｅｙｍ ｕｓｓｅｃａｌｉｎｕｓＴｚｒｅｌ．）杂交的受精和胚胎发育进行了观察．赖草花粉在小麦柱头上萌发良好,花粉管可顺利长入花柱和胚囊,在检查过的３１９个小麦子房中,６２个（１９．４４％ ）发生了双受精,产生了胚和胚乳,但胚乳的发育往往落后于胚的发育;４９个（１５．３６％ ）发生了单卵受精,只产生胚而无胚乳;７个（２．１９％ ）发生了单极核受精,只产生胚乳而无胚．小麦×赖草虽然总受精率可高达３６．９９％ ,然而由于胚乳的缺乏或发育不完全,致使最后结实率很低．从１５０朵授过赖草花粉的小麦颖花中,只得到１粒种子．表明利用胚培养技术对杂种胚进行早期离体培养,可望提高杂种植株的获得率     

Fertilization and Embryo Development in Hybridization Between Wheat and Leymus

Observations were made of the fertilization and embryo development in intergeneric cross between Triticum aestivum L. cv. Chinese Spring and Leyrnus secalinus Tzrel. The pollen germination of Leymus secalinus appeared normal on the stigma of Triticum aestivum and the pollen tubes grew into the style and entered the embryo sacs. Double and simple fertilization were observed in the pollinated florets. Of the 319 ovaries examed 62 (19.44%) had double fertilization and had embryo and endosperm, but endosperm development was slower than that of the embryos, 49 (15.36%) had only embryo and 7 (2.19%) had only endosperm. The total percentage of fertilization was as high as 36.99%. However, only I seed was obtained from 150 wheat ftorets pollinated with Leymus secalinus. This was obviously due to the absence or poor development of the endosperm. It may be suggested that the potential of increasing the frequency of hybrid plant obtainment was great in the cross between wheat and leymus, if embryo culture technique is employed at the early stage of hybrid embryo development.