猪源冠状病毒聚合酶基因的克隆及特性分析

参照GenBank中Purdue株序列对TGEV TS株聚合酶基因(ORF1)设计特异性引物,经RT-PCR扩增获得了20054bp的片段,与预期大小相符.TS株与Pur46-MAD株的ORF1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%和99.0%,与FIPV、PEDV、HCV299E及SARS氨基酸同源性分别为88%、57%、57%和45%.不同冠状病毒比较结果显示RdRp有很高的保守性而且有重要的作用,序列分析标明TS株在ORF1a和ORF1b重叠区有核糖体剪切位点UUUAAAC,且相应区域RNA二级结构形成3个茎环结构.     

猪源肠出血性大肠杆菌CD18株fedA基因的克隆及表达

目的:获得重庆猪源肠出血性大肠杆菌(EHEC)强毒株CD18株fedA基因表达产物。方法:根据GenBank中的fedA基因序列设计引物,从重庆猪源EHEC强毒株CD18株基因组中经PCR扩增目的片段,克隆到pUC19质粒,亚克隆到表达载体pET28b( )的SalⅠ-HindⅢ位点后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni柱法纯化,SDS-PAGE及Western印迹检验表达产物。结果:CD18株fedA与文献报道的fedA的序列同源性为99.3%,推导的氨基酸序列的同源性为98.7%,表达产物在50～100mmol/L咪唑洗脱时出峰,SDS-PAGE显示其相对分子质量20000,Western印迹证明该蛋白条带能与分子标记蛋白His6抗体发生特异反应。结论:克隆到猪源EHECCD18株fedA基因,并在大肠杆菌中得到表达。     

SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取RNA,进行RTPCR扩增其M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZaB,电穿孔法将重组体整合人酵母菌P．pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut^-菌用甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测其表达产物。Mut^-酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约65kDa和42kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性。     

猪Fas基因的克隆及序列分析

广西大学动物科技学院李军、李晓宁、杨坚和罗建荣四位科研工作者从pk-15细胞中提取总RNA,用RT—PCR方法扩增出猪Fas基因,将其克隆到PMD18-T载体上,再进行序列分析,结果表明：克隆的猪Fas基因序列与genBank上登录的猪Fas基因同源性为100％,与人、牛、羊的Fas基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73．4％、79．2％、76．4％和56．2％、67．0％、64．6％。Fas蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、牛、羊与人的基因中呈现较高的同源性。[第一段]     

SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆、表达及活性测定

利用PCR基因扩增法,以SARS冠状病毒全基因质粒为模板,获得N蛋白相应抗原基因,构建了表达载体pBV220／SARS-N,并在E．coli中获得高效表达。用纯化后的N蛋白抗原包被测定板,通过间接ELISA法对阴阳性血清进行活性测定,结果表明,在46份阳性血中有41份被测出,检出率为89．13％。本研究克隆并表达了SARS冠状病毒N蛋白,为进一步研制SARS病人抗体检测试剂和SARS疫苗奠定了基础。     

猪CDC16基因的电脑克隆

利用与人CDC16基因高度同源的猪的EST BP430622、AJ656153、CJ022837和BP161802成功电脑克隆了猪CDC16基因cD．NA全长,结果表明,该基因cDNA全长为2057b,5’-UTR长119bp,3’-UTR长75bp,猪CDC16蛋白由617个氨基酸组成,与人、鼠和酵母的同源性分别为97．6％,95．3％,38．5％,大鼠和小鼠的同源性最高,其次是猪,然后是人。     

SARS冠状病毒M基因的克隆及其表达

从SARS冠状病毒(GD322株)组织培养上清中提取RNA,进行RT-PCR扩增其M基因并克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut+菌用甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测其表达产物.Mut+酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约65kDa和42 kDa的蛋白质,与SARS恢复期病人血清的免疫印迹证实它们为特异的重组M蛋白质,且获得的重组M蛋白质具有免疫反应性.     

猪源冠状病毒TGEV中国分离株纤突蛋白生物信息学分析

以猪源冠状病毒(Porcine coronavirus) TGEV 纤突蛋白基因序列为基础,利用生物软件对TGEV中国分离株纤突蛋白进行N-糖基化位点、跨膜螺旋、进化树、二级结构及抗原位点的预测和分析.结果显示所有TGEV毒株可分为3个基因型,4株中国分离株分别归属于以上3个基因型,属于Ⅰ型的中国株TSX在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上与其他中国株有明显的差异,而同属于Ⅲ型中国毒株SC-Y和TH- 98在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上非常接近,而所有中国分离株抗原表位没有明显差别,表明TGEV在中国没有显著的变异.     

西藏小型猪IGF-1基因的克隆测序分析

目的克隆西藏小型猪的肝脏组织中的IGF-1基因的c DNA序列,并与Pubmed中查询到的猪c DNA进行比对分析。方法提取了西藏小型猪肝脏组织的总RNA,应用RT-PCR技术扩增了IGF-1基因的c DNA序列,将扩增出的片段克隆到p MD18-T载体上,构建重组质粒p MD18-T-IGF-1,进行测序分析。结果克隆出西藏小型猪肝脏组织中的IGF-1的c DNA序列,获得了大小为567 bp长的片段,编码了186个氨基酸,与Pubmed中查询到的猪(NM_214256.1)的IGF-1基因高度同源,比对序列发现,在440、455 bp处发生了G→A、C→T的突变,该位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,分别由组氨酸变成了精氨酸、亮氨酸转变成了丝氨酸。结论为西藏小型猪的生长发育机制研究提供了分子学依据。两个位点的突变引起的氨基酸的改变是否是导致西藏小型猪矮小的原因,需要进一步论证。     

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCVDXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定。该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。与GenBank中已发表的11个CCV毒株s基因相比,s基因核苷酸序列同源性在40．2％-99．5％之间;推导的氨基酸序列同源性在15．9％-99．O％之间。DXMV株s基因变异区主要集中在该基因前1／2处,其中350．370、439．478、1718．1818三个区域碱基变异较大,而1060．1700区却十分保守。基于s全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和USpatent株亲源关系最近。推导的DXMV株s蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc．1弱毒多一个;其中第566．568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的。另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究。     

猪白细胞介素-18基因克隆、序列分析及其真核表达载体的构建

采集6月龄河南良杂猪的脾脏,分离淋巴细胞后直接提取总RNA,进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增,扩增产物进行T-A克隆、测序,获得了河南良杂猪IL-18全基因序列,序列测定表明,plL-18全基因核苷酸长度为579bp,编码 192个氨基酸。与GenBank上已发表序列ABO10003进行比较,核苷酸同源性为99.8%,在第550位处 (以ATG为1计)由A→G,存在有意义突变。与GenBank下载读取的ABO10003、AF176949、AY262109、NM1997序列进行比较分析,氨基酸同源性分别为99%、98.5%和99.8%、99%。将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA-ILl8m,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为核酸疫苗的研究应用奠定了基础。     

短小芽孢杆菌degQ基因的克隆与鉴定

degQ基因编码一个由46个氨基酸组成的多肽,能增强许多芽孢杆菌胞外酶基因的表达．以pMK4作克隆载体构建短小芽孢杆菌基因文库,并用DNA探针原位杂交法从中钓出degQ基因．对克隆基因的DNA序列进行了分析并证明克隆的短小芽孢杆菌degQ基因具有增强枯草杆菌蛋白酶和果聚糖蔗糖酶基因表达的能力．degQ基因克隆有助于研究芽孢杆菌的正调控机理并可望提高外源基因在芽孢杆菌中表达．     

猪流行性腹泻病毒功能性受体的鉴定

为研究猪氨基肽酶(Porcine Aminopeptidase N,pAPN)是否作为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的细胞感染受体,通过转染技术,使PEDV非容许性细胞MDCK表达pAPN,并用PEDV感染转染细胞。结果发现转染的MDCK细胞可以感染PEDV,并且该病毒可以在转染细胞中连续传代。免疫荧光法鉴定存在病毒抗原。进一步实验证实,抗pAPN血清可以抑制PEDV感染转染的MDCK细胞。这些结果展示转染的MDCK细胞、pAPN表达及PEDV病毒复制之间存在直接联系,证明pAPN是PEDV的细胞感染受体之一。     

鸽源冠状病毒核衣壳基因克隆及分子进化分析

目前最新研究发现, 冠状病毒除能感染鸡、火鸡外,也能感染孔雀、鹧鸪、海鸟、灰雁、野鸭、野鸽等多种禽类[4-5].2005年初笔者从以呼吸锣音、上呼吸道粘液异常增多、气管壁出血、胰脏肿大充出血和肺脏出现肉样病变为主要特征的病鸽中分离到1株病毒,通过形态学观察、动物回归试验、鸡胚接种试验、血凝特性试验等证实为冠状病毒,暂命为PSH[2].本研究对PSH N基因进行了克隆和序列分析,其目的一方面是为揭示该病毒N结构基因的变异特点和该病毒的遗传演化规律;另一方面为进一步研制出快速诊断试剂和安全有效的基因工程疫苗及防治鸽源冠状病毒病奠定良好的基础.     

鸽源冠状病毒核衣壳基因克隆及分子进化分析

目前最新研究发现,冠状病毒除能感染鸡、火鸡外,也能感染孔雀、鹧鸪、海鸟、灰雁、野鸭、野鸽等多种禽类[4-5]。2005年初笔者从以呼吸锣音、上呼吸道粘液异常增多、气管壁出血、胰脏肿大充出血和肺脏出现肉样病变为主要特征的病鸽中分离到1株病毒,通过形态学观察、动物回归试验     

应用聚合酶链反应突变和克隆HIV-lgag基因片段

作者设计并合成了一对突变引物PGO1和PGO2,分别在两引物中设计了两个突变点,使突变后基因含有EcoRI、BamHI和ATG及TAA序列,以便于HlV-1gag基因序列的定向克隆和表达。用PCO1和PGO2作引物,采用PCR方法从HIV-1基因组DNA中扩增出一个长504bp的DNA片段,用EcoRl和BamHI双酶切位点将此片段定向克隆入pUC19质粒。将克隆基因插入M13mp18进行DNA序列分析,结果表明,该基因序列及读框完全正确,且在其5′末端突变出EcoRI位点和ATG起始码,3′末端突变出TAA终业码和BamHI位点,从而为该基因的表达研究奠定了基础。     

犬冠状病毒大熊猫株纤突蛋白全基因的克隆与序列分析

在国内首次对犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV)纤突蛋白基因进行了克隆和序列测定.该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白.与GenBank中已发表的11个CCV毒株S基因相比,S基因核苷酸序列同源性在40.2%～99.5%之间;推导的氨基酸序列同源性在15.9%～99.0%之间.DXMV株S基因变异区主要集中在该基因前1/2处,其中350-370、439-478、1718-1818三个区域碱基变异较大,而1060-1700区却十分保守.基于S全基因及其蛋白的聚类分析表明,DXMV株与K378、NVSL和US patent株亲源关系最近.推导的DXMV株S蛋白氨基酸序列潜在的N-联糖基化位点与CCV强毒V54相同,为34个,比Insavc-1弱毒多一个;其中第566-568位糖基化位点为多数强毒拥有而弱毒没有的.另外,DXMV株S蛋白疏水性及抗原表位与其它毒株有一定的差异,这些差异对DXMV株致病性和免疫原性等影响尚待进一步的研究.     

Cloning and Tissue Expression Characterization of the Chicken APOB Gene

Apolipoprotein B (APOB) serves an essential role in the assembly and secretion of triglyceride-rich lipoproteins and lipids transport. This study was designed to clone the full-length cDNA of the chicken APOB gene, to characterize the expression profile, and investigate the differential expression between layer and broiler of the chicken APOB gene. The full-length cDNA sequence (14,150-bp) that contained a 13,896-bp ORF encoding 4,631 amino acids was obtained by RT-PCR, RACE, and bioinformatics analysis. qReal-Time PCR analysis showed that the chicken APOB gene was highly expressed in kidney, liver, and intestine. The results of differential expression showed that the APOB gene was more highly expressed in intestine and kidney in Bai'er layer than in broiler, but there was no significant difference in liver between the two breeds. The results of this study provided basic molecular information for studying the role of APOB in the energy transportation in avian species.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT—PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(ofr7),克隆到pMDl8—T载体构建成重组质粒pMDl8N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCCVR—2332株的同源性为100％,表明ofr7是PRRSV基因组内很保守的序列;将ofr7亚克隆到原核表达载体pGEX—KG,构建成重组质粒pGEX—KGN,用pGEX—KGN转化表达菌株BL21,经SDS—PAGE和Western-blot分析表明：克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST—N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础。