基于同源重组的裂殖壶菌遗传转化体系的构建及验证

【目的】裂殖壶菌是一种能高效生产DHA的海洋真菌;基因工程技术已经成功应用在微生物改造和代谢机理研究中,利用基因工程技术对裂殖壶菌进行改造首先需要构建适合裂殖壶菌的遗传转化体系;【方法】本文利用电转化的方法将含有18S r DNA同源重组片段的ble基因导入裂殖壶菌中,通过zeocin抗性平板筛选出阳性菌株,并设计ble基因引物,以裂殖壶菌基因组为模板,进行PCR验证ble基因是否成功结合到裂殖壶菌染色体上。【结果】筛选获得的抗性菌株基因组上确实PCR出ble基因片段,对改造菌株与原始菌株进行发酵培养,发现改造后菌株在生物量、油脂含量、DHA含量及脂肪酸分布等方面和原始菌株基本一致。【结论】抗性基因的插入不会影响菌株的正常代谢,该体系的构建为后续其他外源基因导入奠定基础。     

外源添加剂促进裂殖壶菌合成DHA

为提高二十二碳六烯酸（DHA）产量,根据裂殖壶菌生物合成DHA的代谢途径,考察外源添加剂对裂殖壶菌发酵生产DHA影响。研究表明：分生物素、柠檬酸、苹果酸和洛伐他汀均能提高裂殖壶菌DHA的合成能力。同时添加生物素、苹果酸和洛伐他汀时能够显著提高DHA的产量,DHA的最高产量达到11.55 g/L,相比对照提高71.87%。     

添加生物素和浅蓝菌素对裂殖壶菌发酵产DHA的影响

为提高发酵产量,根据裂殖壶菌生物合成二十二碳六烯酸(DHA)的途径,考察添加代谢途径关键酶的辅酶及酶的抑制剂对发酵裂殖壶菌的影响.结果表明:添加生物素可促进油脂积累,添加浅蓝菌素有利于DHA及不饱和脂肪酸含量的提高.添加生物素0.3 mg/L时,DHA占细胞干质量分数达11.26％,相对于对照提高了13％;当添加浅蓝菌素0.1mg/L时,DHA占细胞干质量分数可达12.2％.     

渗透压调控对裂殖壶菌发酵产DHA的影响

考察了不同渗透胁迫(0、10、20、30和40 g/L NaCl)对裂殖壶菌HX-308发酵产DHA及脂肪酸构成的影响。结果表明:20 g/L NaCl最有利于裂殖壶菌生长和DHA积累,生物量、总脂肪酸含量、DHA产量及DHA占生物量的比值分别为73 g/L、10.7 g/L、5.0 g/L和68 mg/g,并且DHA在总脂肪酸中所占百分比最高,为45.2%。此外,在低渗透压(10 g/L NaCl)条件下,添加40 mmol/L甘氨酸甜菜碱,DHA产量与未添加相比提高了28.21%;在高渗透压(40 g/L NaCl)条件下添加40 mmol/L海藻糖,DHA产量提高了46.84%;表明添加适量的外源相容性溶质能有效地促进裂殖壶菌积累DHA。     

利用原生质体融合技术选育淀粉发酵产DHA的新型裂殖壶菌

以生产DHA的裂殖壶菌(Schizochxtrium)B4D1和黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 3.316为出发菌株,利用原生质体融合技术选育可以利用淀粉发酵生产DHA的新型裂殖壶菌。用裂解酶制得了两亲本的原生质体,通过研究两亲本培养时间、培养方法、酶解时间等条件对原生质体产量影响的基础上,以PEG介导进行了原生质体的融合,最终确定了原生质体融合最佳条件为40%的PEG6000,融合温度30℃,融合时间为10 min,在此条件下融合率可达1.9%。通过比较菌落外观、颜色、形态以及分离培养筛选获得了一株利用淀粉裂殖壶菌融合子。经过RAPD验证表明B4D1与CGMCC 3.316发生了重组,融合菌株表达了更多源于B4D1的遗传信息。     

搅拌和通气对裂殖壶菌LX0809产DHA的影响

利用一株生产DHA专利菌株裂殖壶菌LX0809,在10 L全自动发酵罐中考察了16个搅拌转速和通气量组合对裂殖壶菌LX0809发酵产DHA的影响。生物量和总油脂的产量随搅拌转速和通风量的增加而增加,DHA占总油脂比例随搅拌转速和通风量的增加而降低,最终确定通气量为全程0.3 m3/h(通气比0.83),搅拌转速为前40 h 400 r/min,后56 h 300 r/min。发酵96 h放罐,细胞生物量92 g/L,油脂质量浓度52.3 g/L,DHA占总油脂含量为40.2%,DHA发酵产量高达21 g/L。     

超氧化物歧化酶、丙二醛、脯氨酸作为裂殖壶菌菌种性能评价的新指标

[目的]对不同Schizochytrium sp.HX-308种子期超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)进行测定,旨在寻找出一种评价菌种质量优劣的新方法.[方法]选用Schizochytrium sp.HX-308中的1株驯化高产菌株和1株原始菌株在正常条件下活化,以及同一原始菌株分别在正常条件和恶劣条件下活化的2组实验,分别通过WST-1法、巴比妥酸比色法和比色法测定SOD、MDA和Pro含量,探讨不同菌株中这3个指标与裂殖壶菌Schizochytrium sp.HX-308最终发酵性能之间的关系.[结果]发酵性能最佳的驯化菌株整个种子期的SOD、MDA和Pro含量都最低,平均仅为0.025 U/g、26.20 mmol/g· Fw和0.098 mg/g· Fw,而发酵性能最差的恶劣条件下菌株的SOD已达到了它的6倍以上,MDA和Pro也达到了2倍以上.[结论]本研究最终证实,这3个指标与菌株的发酵性能呈负相关关系,可以作为评价裂殖壶菌菌株发酵性能优劣的新指标,为菌株选育的优化提供了指导.     

强化乙酰辅酶A供应对裂殖壶菌合成二十二碳六烯酸的影响

细胞液中乙酰辅酶A的持续供应是脂肪酸高效积累的必要条件。考虑到甲羟戊酸和脂肪酸合成途径共用相同的前体乙酰辅酶A,抑制甲羟戊酸途径可能促使更多的乙酰辅酶A流向脂肪酸合成。通过添加前体物质或/和甲羟戊酸途径酶的抑制剂以强化乙酰辅酶A的供应,即在裂殖壶菌发酵起始或/和后期添加乙酸、发酵起始添加甲羟戊酸途径酶的抑制剂辛伐他汀或柠檬酸、发酵起始同时添加乙酸和辛伐他汀或柠檬酸并考察其对裂殖壶菌合成二十二碳六烯酸 (DHA)的影响,结果发现发酵起始同时添加6mmol/L的乙酸和1μmol/L的辛伐他汀时,DHA产量最高,达到13.21g/L,比对照提高了46.61%。     

裂殖壶菌Schizochytrium sp. 20888产DHA培养条件优化

【目的】为了优化裂殖壶菌产DHA的培养条件,提高油脂中DHA含量。【方法】采用单因素试验和正交设计试验方案,针对分批培养时间、培养基碳、氮源的种类和浓度以及培养温度开展试验,采用重量法测定生物量、采用索氏提取法测定油脂总量,采用气相色谱法测定油脂DHA含量,考察培养条件对细胞油脂DHA含量的影响。【结果】最适培养时间为4 d,培养温度23°C,最优碳氮源组成为(g/L):葡萄糖65、甘油80、蛋白胨6、酵母粉4和谷氨酸钠8。【结论】裂殖壶菌Schizochytrium sp.20888在葡萄糖和甘油组成的复合碳源和由蛋白胨、酵母粉和谷氨酸钠组成的复合氮源的培养基中可以得到最优的DHA产量,细胞DHA含量能达到33.68%。     

裂殖壶菌高产油突变体的高通量筛选

二十二碳六烯酸(DHA)具有促进婴幼儿大脑和视网膜发育等多种生理功能,被广泛应用于食品、医药和养殖等行业。为了获得适合于工业化生产的高产油、高产DHA的裂殖壶菌工程株,文中建立了一套操作简单、快速准确的基于尼罗红染色的高通量筛选方案。首先利用紫外线(UVC)诱变的方式快速构建裂殖壶菌的随机突变体库。然后采用优化后的筛选条件如裂殖壶菌的最佳尼罗红染色条件(二甲基亚砜浓度为20%,尼罗红终浓度为2.0μg/mL,孵育时间为10 min,孵育温度为40℃)和更合理的筛选依据(多功能酶标仪实现高通量测量的单位细胞密度油脂量)等,对3 648株突变体进行筛选,得到了3株高产油突变体(D03432、D05106和D01521)。摇瓶发酵实验表明,这3株突变体在生物量、油脂含量和DHA产量上均高于野生型菌株,其中突变体D03432和D05106的油脂量分别达到了干重的64.74%和63.13%,远高于野生型菌株的43.19%。而且这两株突变体的DHA产量分别是野生型菌株的2.26倍和2.37倍。最后,对突变体D03432和D05106进行了5 L发酵罐发酵培养,相较于野生型菌株,这两株突变体不仅生物量和油脂含量有所增加,而且DHA产量更是分别增加了45.5 1%和66.46%,展现出较好的工业应用潜力。此外,本筛选方案对其他产油微生物高产油突变体的高通量筛选具有借鉴作用。     

一株具有工业化生产DHA前景的破囊壶菌

多不饱和脂肪酸是保持人体健康不可缺少的营养成分之一,尤其是二十二碳六烯酸(DHA)作为细胞膜磷脂的重要组分,具有非常重要的医药应用和营养价值。目前,在食品工业中,DHA已经添加至牛奶或奶粉中,用作功能性营养强化剂。20世纪80年代,DHA的唯一来源是鱼油,但鱼油的腥味、重金属污染等问题,促使人们探索生产DHA的其他途径如微生物发酵。诱变和筛选是微生物选育过程中比较重要的手段,可以快速使菌株朝着人类所需要的方向突变。UV诱变和化学药物胁迫筛选是使野生株定向突变的一种很好的办法。目前国内外研究主要针对裂殖壶菌属菌株进行诱变育种,许永利[1]用紫外线诱变和喹禾灵筛选方法对裂殖壶菌(Schizochytrium limacinu)进行诱变选育,突变菌株生物量和DHA含量比对照菌株均有提高。吴克刚等[2]利用添加植物激素对Thraustochytriu roseum MF2进行培育诱变,从而获得更高的DHA量,但在脂质含量和DHA在脂质占比率上都不存在明显变化。本期介绍梁园梅、成家杨等[3]发表的论文《高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变株的筛选》,作者采用紫外线和药物双重诱变胁迫破囊壶菌获得一株突变株,其在生物量、脂质含量和DHA在脂质占比率上都有显著性提高,相比前人的研究,作者获得的突变株有显著优越性,且突变株DHA生产能力传代4次后仍然保持稳定,具有较高的工业价值。在后续的研究中作者若能对筛选条件、培养基(如利用廉价碳源)和培养条件等方面实行进一步优化,提高突变株生物量,降低突变株发酵生产DHA生产成本,将能获得更高的商业价值。     

裂殖壶菌发酵产DHA过程呼吸参数的在线检测分析

利用尾气分析仪对发酵过程的尾气中的O2、CO2含量进行实时检测,建立了裂殖弧菌发酵生产DHA过程中的呼吸参数在线检测方法,实现了裂殖壶菌补料分批发酵过程及双阶段供氧控制发酵过程中的呼吸参数在线检测分析。通过呼吸参数在线检测分析,从氧消耗机制方面解释了双阶段氧传递控制工艺能获得较高生物量、油脂和DHA含量的原因,从而为该工艺过程提供了理论指导。根据发酵过程中菌体生长不同时期的呼吸参数的变化情况,建立了基于呼吸商变化的在线补料控制方法,设计了一种基于RQ-Stat的补料工艺。RQ-Stat补料方式最终获得的油脂含量、DHA产量和产率比间歇式补料工艺分别提高了11.58%、12.19%和11.40%。     

1株裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)的分离鉴定

采用松树花粉诱集法从乐清湾红树林分离到一株纯培养物,其特点为：营养菌体为椭圆球形,单核;营养菌体的细胞壁由许多紧压在一起的致密鳞片层构成,在细胞壁不连续处可分辨鳞片;营养菌体形成外质网,它产生于外质网形成体;营养菌体以产生游动孢子行无性繁殖,游动孢子为双鞭毛;无性繁殖过程中形成四分体结构。据此鉴定为裂殖壶菌（Schizochytrium sp．）。     

1株裂殖壶菌(Schizochytrium sp.的分离鉴定*

采用松树花粉诱集法从乐清湾红树林分离到一株纯培养物,其特点为:营养菌体为椭圆球形,单核;营养菌体的细胞壁由许多紧压在一起的致密鳞片层构成,在细胞壁不连续处可分辨鳞片;营养菌体形成外质网,它产生于外质网形成体;营养菌体以产生游动孢子行无性繁殖,游动孢子为双鞭毛;无性繁殖过程中形成四分体结构。据此鉴定为裂殖壶菌(Schizochytrium sp·)。     

裂殖壶菌SD116油脂的胞内核磁共振研究

胞内核磁共振方法通常用于在原位对细胞内的标记蛋白质进行分析。产油微生物胞内油脂含量极高,理论上也可以使用胞内核磁共振方法对其油脂进行研究。作者使用一株高产多不饱和脂肪酸DHA的裂殖壶菌SD116,对其进行了胞内核磁共振分析。归属了胞内核磁共振氢谱和碳谱的谱峰,鉴定了胞内核磁共振谱图中饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的特征谱峰,并对比了大肠杆菌和产油酵母的胞内核磁共振谱图。结果表明,胞内核磁共振方法可以有效地分析产油微生物细胞中的油脂。     

菌种保藏方法对裂殖壶菌生长及发酵性能的影响

考察保护剂、保藏温度及预冷冻方法对Schizochytrium sp.HX-308菌种存活率及发酵性能保持的影响。结果显示:在-80℃低温保藏6个月后,渗透性保护剂的细胞存活率均比非渗透性保护剂高了5%,其中用60%(质量分数)海藻糖的保护剂最终的株细胞存活率达到80.02%,明显优于其他保护剂。采用液氮-196℃保藏菌种(两步预冷冻法、60%海藻糖保护剂),存储6个月后存活率高达90.70%,生物量、油产量和二十二碳六烯酸(DHA)产量分别达到了61.65、26.41和11.10 g/L,为最优的保藏方法,为裂殖壶菌的实验室研究及工业化生产提供了一种长期安全的保藏法。     

壶菌感染对两栖动物种群影响的研究现状与挑战

加强生物多样性保护与共建地球生命共同体是我国的重大战略。两栖动物是脊椎动物中生物多样性受威胁最严重的类群,两种壶菌Batrachochytrium dendrobatidis (Bd)和B. salamandrivorans (Bsal)的感染是两栖动物多样性下降的主要因素之一。Bd主要感染两栖动物无尾目、有尾目和蚓螈目的皮肤,可能引起两栖动物淋巴细胞凋亡和全身电解质失衡。Bsal主要感染有尾目,可能导致两栖动物致命的败血症。针对壶菌及其感染对两栖动物种群影响的研究在国外已经开展了大量工作,然而我国在该领域的研究有限。本文通过检索1990–2022年国内外文献,梳理和总结了壶菌病原的可能起源与传播、壶菌感染的发病机制、壶菌毒力的影响因素和壶菌病原体的诊断与防治等领域的研究,并提出了未来的研究方向和技术方法的改进需求,如利用全基因组测序技术溯源、开发RPA技术进行野外检测和应用转录组学研究宿主–病原体的免疫等。最后,提出以下4条建议:(1)建设壶菌病原基础数据平台,建立壶菌病常规检测部门,并将壶菌病监测纳入野生动物疫病监测体系;(2)深入开展我国两栖动物不同地理区系壶菌感染情况的相关研究...     

中华血簇虫的生活史研究(复顶门:孢子纲) Ⅱ.中华血簇虫在中华鳖中的发育

中华血簇虫在其无脊椎动物寄主中的发育已另有文描述。这里报道的是中华血簇虫在中华鳖中的发育。这一时期包括三个阶段:组织细胞内裂体增殖、深部血红细胞内的裂体增殖和外周血红细胞内的裂体增殖。组织细胞内裂殖体产生14—32个裂殖子。深部血红细胞内的裂殖体分为两类:一类是X裂殖体,它产生14—18个小裂殖子;另一类是Y裂殖体,它产生4—6个大裂殖子。外周血红细胞内的初期裂殖体可产生多至14个裂殖子,而随后的裂体增殖却产生越来越少的裂殖子,且裂殖体和裂殖子的大小也渐趋变小。外周血晚期的裂殖体只形成2个裂殖子。配子母细胞来源于Y裂殖子。营养体是由上一代裂殖子向下一代裂殖体发育的中间时期。     

环形泰勒焦虫裂殖体细胞培养及其免疫原性的研究

1.本实验中所试用的BLS和“乳叶”培养液,都能良好地支持环形泰勒焦虫裂殖体感染的成淋巴细胞贴壁和悬浮生长,在4天内细胞量增殖5倍以上,传代以后的成淋巴细胞95%以上都寄生有裂殖体。成淋巴细胞“乳叶”培养液中,已连续传代培养15个月以上,仍生长良好,初步证明某些培养液中所加入的多种维生素等成份,对促进寄生有裂殖体的成淋巴细胞的生长繁殖,不是必要的。 2.传代细胞内的裂殖体,仅见无性裂殖体一种。裂殖体的分裂方式与宿主细胞的有丝分裂是密切相关的,在成淋巴细胞分裂的后期,裂殖体核沿纺锤丝排列成一行或数行,然后几乎被均等地分配到两个子细胞中去。裂殖体是细胞分裂的一种强烈刺激物。 3.成淋巴细胞在明胶制剂中,于4—6℃下保存到40—50天仍不失其再生长繁殖的能力。 4.裂殖体具有坚强的免疫原性,接种牛体后可产生抗环形泰勒焦虫病的免疫力。传代培养45天,2个半月和5个半月的细胞接种牛体后,前二种细胞形成带虫免疫,后者为非带虫免疫,安全性皆表现良好。经蜱叮咬攻毒,17头牛100%得到保护。516×10~5—5×10~6细胞剂量均安全有效。用明胶制剂作为保护剂,所制的胶冻细胞苗在4—6℃下保存20天和30天,对牛体仍然可产生坚强的保护能力,即疫苗的有效保存期可达30天。     

破囊壶菌利用工农业废弃物生产脂肪酸的研究进展

破囊壶菌因具有高产脂肪酸的特性而受到广泛关注,然而传统的培养方式需要的原料成本很高,很大程度上阻碍了破囊壶菌的工业化进程,因此,寻找可被破囊壶菌高效利用、来源广泛并且廉价易得的生产原料成为该领域的研究重点。本文以破囊壶菌及其生产脂肪酸为切入点,综述了近年来破囊壶菌利用工农业废弃物生产脂肪酸的研究现状,总结并提出了其发展前景,以期对今后的研究有所启发。