EB病毒潜伏膜蛋白1基因对上皮细胞增殖的影响

为了研究ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１（ＬＭＰ１）基因对上皮细胞增殖的影响,探索ＬＭＰ１在上皮细胞肿瘤发生中所起的作用。用ＬＭＰ１基因真核表达质粒转染人胚肾上皮细胞,检测了转染细胞中ＬＭＰ１的表达,观察细胞在软琼脂中的集落形成能力、ＭＴＴ吸收能力以及ＰＣＮＡ的表达情况。结果显示,被ＬＭＰ１基因转染的细胞生长旺盛,能在软琼脂中形成多个集落,ＭＴＴ吸收能力增强,ＰＣＮＡ的表达水平增高。因此认为ＬＭＰ１基因能明显改变上皮细胞的生物学行为,促进细胞的生长、增殖和转化,使转染的上皮细胞获得肿瘤细胞的生长特征     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGl在CHO细胞中的高效表达

为了得到ｔＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧＩ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线性化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯｄｈｆｒ－）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１０６细胞·２４ｈ的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间约为３６ｈ,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株     

Egr-1基因调控序列连接OSM cDNA表达质粒的构建及其在黑色素瘤细胞中的表达

ＯＳＭ是一种对黑色素瘤细胞显示抑制作用的细胞因子．为进行ＯＳＭ针对黑色素瘤的基因－放射治疗研究,构建了小鼠Ｅｇｒ－１基因调控序列引导入ＯＳＭｃＤＮＡ真核表达质粒（ｐＥＯ）,ｐＥＯ质粒转染小鼠Ｂ－１６黑色素瘤细胞,经Ｇ４１８和抗人ＯＳＭ抗体的筛选,获得了稳定表达ＯＳＭ的克隆细胞（ｐＥＯ－１细胞）,ＯＳＭ表达量可达５．９７ｎｇ每１０５细胞天,分子量为３２ｋＤ．ｐＥＯ－１细胞用一定浓度Ｈ２Ｏ２处理后ＯＳＭ表达量可提高６２％,表明ｐＥＯ重组质粒可在氧自由基的刺激作用下增强ＯＳＭ表达     

表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免？…

将将城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株融合蛋白基因导入鸡痘病毒（ＦＰＶ）插入载体ｐＥＧＦ１１７５－１的Ｐ７．５启动子下游,得到转移载体ｐＦＧ１１７５－１重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染ＦＰＶ２８２Ｅ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）。,经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒ｒＦＰＶ－ＮＤＦ。间接免疫荧光试验表明,ｒＦＰＶ－ＮＤＦ感染的ＣＥＦ中表达了ＮＤＶ的融合蛋白。用ｒＦＰＶ－ＮＤＦ免疫的ＳＦ     

细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定

从人外周血单核细胞中抽提总ＲＮＡ为模板,分别用５‘含ＥｃｏＲⅠ３含ＢａｍＨＩ限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物成含信号肽全长ＩＬ－２,γ－ＩＦＮ及α－ＴＮＦｃＤＮＡ。然后将这些细胞因子ｃＤＮＡ分别重组入含筛选标记基因Ｎｅｏ逆转录病毒载体ＬＸＳＮ中,采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系ＰＡ３１７。分别收集到含ＩＦＮ－γ,ＴＮＦ－α和ＩＬ－２基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒ｐＬＸＳ     

植物抗病基因工程进展(续)

植物抗病基因工程进展（续）洪剑明印莉萍邱泽生（首都师范大学生物系北京１０００３７）ＰＲＯＧＲＥＳＳＯＦＧＥＮＥＴＩＣＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧＦＯＲＰＬＡＮＴＤＩＳＥＡＳＥＲＥＳＩＳＴＡＮＣＥＨＯＮＧＪｉａｎＭｉｎｇＹＩＮＬｉＰｉｎｇＱＩＵＺｅＳｈ...     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）组合突变体FrGGl在CHO细胞中的…

为了得到ｔ－ＰＡ组合突体ＦｒＧＧｌ在ＣＨＯ细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）去除,构建了ＦｒＧＧｌ真核表达质粒ｐＺＬＦｒＧＧＩ。酶切线化后,采用大剂量ＤＮＡ电击介导法,转染ｄｈｆｒ基因缺陷型中仓鼠卵巢细胞系（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ）。氨甲喋呤（ＭＴＸ）筛选转染细胞,混合加压,挑选克隆,在１×１０＾－７ｍｏｌ／ＬＭＴＸ压力下,获得表达水平达１５００～２５００ＩＵ／１     

云南黍属(禾本科)一新种

云南黍属（禾本科）一新种彭华周丽华（中国科学院昆明植物研究所昆明６５０２０４）ＡＮＥＷＳＰＥＣＩＥＳＯＦＴＨＥＧＥＮＵＳＰＡＮＩＣＵＭＬ．（ＰＯＡＣＥＡＥ）ＦＲＯＭＹＵＮＮＡＮ,ＣＨＩＮＡＰＥＮＧＨｕａＺＨＯＵＬｉＨｕａ（ＫｕｎｍｉｎｇＩｎｓｔｉ...     

金属硫蛋白 - 潜伏膜蛋白融合基因的体外转录调控

ＥＢ病毒（ＥＢＶ）是一种与地区性伯基特氏淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金氏病等多种人体肿瘤有关的疱疹病毒．已往的研究表明,潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）基因是ＥＢＶ最可能的致瘤基因．为制备ＬＭＰ基因转基因小鼠,探讨ＬＭＰ的体内致瘤作用,首先构建了含鼠金属硫蛋白－１（ＭＴ－１）基因调控区和ＬＭＰ基因编码区的ｐＢＲ３２２－ＭＴ－ＬＭＰ质粒,并用电击法将该质粒与ｐＫＪ１－Ｎｅｏ质粒共转染人胃癌细胞株ＭＧＣ,对ＭＴ－ＬＭＰ基因在转染细胞中的整合、转录情况及重金属镉和镍对该融合基因的转录调控进行了研究．结果表明：（１）两质粒共转染效率为８６．７％;（２）ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析显示,完整的ＭＴ－ＬＭＰ基因已整合入转染的ＭＧＣ细胞基因组,且在不同的转染细胞克隆中,ＭＴ－ＬＭＰ基因整合的方式及拷贝数不同,拷贝数从１到１９不等;（３）ＲＴ－ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析证实,ＭＴ－ＬＭＰ基因不仅在转染的ＭＧＣ中能够转录,而且在１０μｍｏｌ／Ｌ镉诱导下,ＭＴ－ＬＭＰ基因转录增强,平均增高约１．４倍．结果说明,在ＭＴ－１基因调控区指导下,ＬＭＰ基因不但有ｍＲＮＡ水平的表达,而且其表达受重金属镉的调控,上述结果为制备ＭＴ－ＬＭＰ转基因小鼠     

含人IL—2基因的真核表达质粒的构建及其在真核细胞…

本工作用ＰＣＲ由人的外周血单个核细胞ｃＤＮＡ中获取了带有信号肽的ＩＬ－２全ｃＤＮＡ克隆,并构建了不同的表达质粒：带有ＳＶ４０启动子的以质粒为载体的ｐＳＶＫ３－ＩＬ２和以逆转录病毒为载体的ｐＬＮ－ＩＬ２系列?ｐＬＮＣＩＬ２,ｐＬＮＳＩＬ２,ｐＬＩＬ２ＳＮ,它们分别带有ＣＭＶ、ＳＶ４０和ＬＴＲ启动子。用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法、ＳＡ－脂质体法和电穿孔等方法分别将这些ＩＬ－２表达质粒转染入ＣＯＳ－７及     

马铃薯Y病毒普通系外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

将马铃薯Ｙ病毒普通系（ＰＶＹ０）的外壳蛋白基因克隆到表达质粒ｐＭＡＬｃ２中,构建这一基因在大肠杆菌中的表达载体ｐＭＡＬｃ２ＰＶＹ０ＣＰ。ＳＤＳＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ检测结果表明,这一表达栽体在Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α中经ＩＰＴＧ诱导可表达分子量为７１．８ｋＤａ的特异性融合蛋白。以ａｍｙｌｏｓｅｒｅｓｉｎ亲合柱层析纯化这一融合蛋白为抗原,免疫家兔制备了效价为１∶１０２４的特异性抗血清。用该抗血清可通过对流免疫电泳、免疫双扩散及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ对ＰＶＹ进行检测     

人IL-2/IFNα2b融合基因在肝癌细胞中靶向表达

 根据细胞因子之间协同作用的特点,采用重组 Ｄ Ｎ Ａ 技术设计并构建了人 Ｉ Ｌ ２ 与 Ｉ Ｆ Ｎα融合基因,并用肝癌组织特异的 Ａ Ｆ Ｐ增强子／ Ａ Ｌ Ｂ启动子调控融合基因在肝癌细胞中的靶向表达．实验结果表明,克隆的 Ｅ Ａ Ｆ Ｐ Ｐ Ａ Ｌ Ｂ联合转录调控序列能调控细胞因子基因在 Ａ Ｆ Ｐ阳性人肝癌细胞中靶向表达, Ｉ Ｌ ２／ Ｉ Ｆ Ｎα２ｂ 融合基因的表达水平与感染肝癌细胞的 Ａ Ｆ Ｐ表达水平呈正相关性．实验证明表达的融合蛋白具有 Ｉ Ｌ ２ 和 Ｉ Ｆ Ｎ 两种生物学活性的细胞因子．这可能为肝癌基因治疗开辟新途径．     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

FEN—1基因反义阻断细胞株（FL—FEN—1^—）的建立

ＦＥＮ－１是一咱结构特异性核酸酶,它在ＤＮＡ复制和修复过程中都起着重要的作用。将ＦＥＮ－１基因的ＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ片段反向克隆到哺乳动物细胞重组表达质粒ｐＭＡＭｎｅｏＡｍｐ＾－中,得到ＦＥＮ－１反义表达质粒ｐＭＡＭｎｅｏＡｍｐ＾－ＦＮＢ＾－,并转染ＦＬ细胞,经Ｇ４１８筛选后,获得ＦＥＮ－１基因表达被阻断的哺乳动物细胞ＦＬ－ＦＥＮ－１＾－。对细胞生长曲线的测定发现,ＦＬ－ＦＥＮ－１＾－在地塞米松的     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中通过NFκB促进Igκ表达

利用已建立的受四环素调控ＬＭＰ１表达的鼻咽癌细胞系,用受ＣＭＶ启动子调控的ＮＦκＢ报道基因质粒ｐＮＦκＢ－ｌｕｃ的荧光素酶表达分析ＮＦκＢ的活性,并以核蛋白的Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法观察ＬＭＰ１表达前后核内ＮＦκＢ组分ｐ６５量的改变,用全蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析Ｉｇκ蛋白质的表达等方法,探讨在鼻咽癌中,ＥＢ病毒ＬＭＰ１蛋白是否通过核转录因子ＮＦκＢ促进免疫球蛋白κ轻链（Ｉｇκ）基因的表达。结果显示     

直接注射质粒DNA表达人G-CSF的研究(英文)

转基因动物研究发展至今,对于所构建的表达载体有效性如何,一直缺乏一个验证体系。由于转基因动物的建立较为繁琐复杂,投资大,因而直接用转基因动物去验证所用元件是不明智的。为此,我们采用小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因（２．６Ｋｂ）为调控序列,人ＧＣＳＦ基因组基因为目的片段,将ＷＡＰ笫一内含子置于ＧＣＳＦ基因５’端,构建成转基因动物乳腺表达载体ｐＩＮＧＧ（Ｆｉｇ．１）。将表达质粒直接注射到怀孕小鼠乳腺。于分婉第８天取乳汁进行ＥＬＩＳＡ检测。在泌乳期小鼠乳汁中检测出人ＧＣＳＦ,表达量达１５３２ｎｇ／ｍＬ（Ｔａｂｌｅ１）。具有一定应用前景。实验中发现：增加注射次数可以提供转染效率,但最佳注射次数仍需摸索。另外,如果换用复制型载体,整合与表达效率有可能大大提高。     

表达新城疫病毒F48E8株血凝素—神经氨酸酶的重组鸡痘病毒的构建 …

在克隆和鉴定新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株血凝素－神经氨酸酶（ＨＮ）基因的基础上,应用分子克隆技术将ＨＮ基因导入鸡痘病毒插入载体ｐＦＧ１１７５－１中启动子Ｐ７．５的下游,得到携带ＮＤＶ－ＨＮ基因的质粒ｐＦＧＨＮ１１７５－１。将此质粒ｐＦＧＨＮ１１７５－１以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株２８２Ｅ４株感染３￣４ｈ的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化３次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用ＮＤＶ－ＨＮ基因特异     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中调控核转录因子κB活性研究

为了探讨ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１（ＬＭＰ１）的致瘤机制,对鼻咽癌细胞中ＬＭＰ１通过核转录因子ｋＢ（ＮＦｋＢ）介导的信号传导途径在鼻咽癌变中的意义进行了研究。利用ＬＭＰ１受四环素衍生物强力霉素诱导表达的鼻咽癌细胞Ｔｅｔ－ｏｎ－ＬＭＰ１ＨＮＥ２,通过ＮＦｋＢ报道基因分析法、凝胶迁移率分析（ＥＭＳＡ）及细胞集落形成率等方法,结合硫代磷酸反义寡核苷酸阻断技术,证实ＬＭＰ１增强鼻咽癌细胞ＮＦｋＢ的ＤＮＡ结合活性