羊蹄叶过氧化物酶的纯化和酶学性质研究北大核心CSCD

采用磷酸缓冲液浸提法提取羊蹄叶POD,对影响酶提取的主要因素(料液比、浸提液p H、浸提温度和浸提时间)进行单因素实验和正交实验,用p H沉淀和丙酮沉淀对酶进行了纯化,并研究了其酶学性质。结果表明,羊蹄叶POD的最佳提取条件是料液比为1∶40,提取液p H为9,浸提温度是35℃,浸提时间为30 min。调节提取液的p H为5以及用1倍和0.8倍体积的丙酮沉淀提取液时蛋白相对沉淀量多和酶的比活性大。羊蹄叶POD以愈创木酚和H2O2为底物的Km分别是0.12 mmol/L和0.62×10-3mmol/L。Cu SO4对羊蹄叶POD活性有激活作用,而Zn SO4、Mg SO4、Ca Cl2、KCl和Na Cl对POD活性有抑制作用。研究证明羊蹄叶POD的提取和纯化方法简单有效,其酶学性质为理解羊蹄植物的生长特性和酶学应用提供依据。     

荔枝果皮过氧化物酶的纯化及部分酶学性质研究

经硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose和Sephadex G-75柱层析分离,从荔枝果皮中分离提纯了过氧化物酶(POD),该酶被纯化了12．5倍,产率为1．9％。经SDS-PAGE确定为单一条带。该酶最适反应温度为35℃,对热具有较强的稳定性,经75℃处理30min,酶活性只损失50％。最适pH约为6．5,但在pH4．0—8．0范围内活力仍比较稳定。该酶在25℃和0．05mol／L磷酸缓冲液(pH7．0)条件下对愈创木酚、邻苯二酚和没食子酸的Km分别是2．75、12．4和12．8mmol／L。二硫苏糖醇和抗坏血酸能完全抑制POD活性,L-半胱氨酸、柠檬酸、FeS04、GSH、SDS和ZnS04对POD活性有一定的抑制作用,而FeCl,和CuSOt对POD则有较好的激活作用。     

龙须菜中溴过氧化物酶的分离纯化及酶学性质分析

对中国北方海域江蓠属养殖龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)进行了溴过氧化物酶分离纯化及性质的研究。粗提液中酶催化检测反应不稳定, 活力单位较低或无; 经DEAE cellulose 52离子交换层析, 去除了结构多糖及藻胆蛋白, 酶催化反应稳定, 得到比活力为2.8的电泳纯溴过氧化物酶。对纯化溴过氧化物酶性质研究表明: 该溴过氧化物酶为单体酶, 分子量约66 kD, 溴化单氯双甲酮时的最适pH值为6.0, 在40°C以下和pH 3.0~9.0之间有很好的稳定性。钒酸盐可提高该溴过氧化物酶的催化活性, 而Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和EDTA等化合物对其有较显著的抑制作用。反应动力学实验表明, 该酶对Br-、H2O2的Km分别为53.5 mmol/L和38 mmol/L。     

龙须菜中溴过氧化物酶的分离纯化及酶学性质分析

对中国北方海域江蓠属养殖龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)进行了溴过氧化物酶分离纯化及性质的研究。粗提液中酶催化检测反应不稳定, 活力单位较低或无; 经DEAE cellulose 52离子交换层析, 去除了结构多糖及藻胆蛋白, 酶催化反应稳定, 得到比活力为2.8的电泳纯溴过氧化物酶。对纯化溴过氧化物酶性质研究表明: 该溴过氧化物酶为单体酶, 分子量约66 kD, 溴化单氯双甲酮时的最适pH值为6.0, 在40°C以下和pH 3.0~9.0之间有很好的稳定性。钒酸盐可提高该溴过氧化物酶的催化活性, 而Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和EDTA等化合物对其有较显著的抑制作用。反应动力学实验表明, 该酶对Br-、H2O2的Km分别为53.5 mmol/L和38 mmol/L。     

豆壳过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

从豆壳抽提液经硫酸铵分级沉淀,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析,ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲合层析和Ｂｉｏ－ＧｅｌＰ－６０凝胶过滤,纯化了豆壳过氧化物酶（ｓｏｙｂｅａｎｈｕｌｐｅｒ－ｏｘｉｄａｓｅ,ＳｈＰ）．纯化酶的比活力为７０７７Ｕ／ｍｇ,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上显示出一条蛋白质带．ＳｈＰ分子量为３８０００,等电点为３．９;ＳｈＰ为一含血红素的糖蛋白,含糖量为１８．７％,光谱学分析揭示,在４０６ｎｍ处有一典型的Ｓｏｒｅｔ带,在５１０ｎｍ和６４０ｎｍ处有特征吸收峰．酶反应的最适ｐＨ在４．０附近,最适温度为４５℃;在ｐＨ２．５～１２．０之间较稳定,７５℃,保温６０ｍｉｎ,酶活力残余６８％,ＳｈＰ是一种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶．动力学分析求得ＳｈＰ的表观Ｋｍ（愈创木酚）为１．６２ｍｍｏｌ／Ｌ,表现Ｋｍ（Ｈ２Ｏ２）为０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ．在所测定的化学试剂中,Ｎ－３、ＣＮ－、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋和Ｓｎ２＋对酶有较强烈的抑制作用,而重金属离子Ａｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｒ３＋以及ＳＤＳ和ＥＤＴＡ对酶活力无显著影响     

人肝谷胱甘肽过氧化物酶纯化及性质研究

经硫酸铵分级沉淀,离子交换层折和凝胶过滤等步骤,从人肝中获得了ＰＡＧＥ单一条带的谷胱甘肽过氧化物酶,比活提高１２０倍,得率为２５％。凝胶过滤法测得分子量为９０９０８０,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定亚基分子量为２２４２３,原子吸收法测得每分子酶含有四个硒原子,等电聚焦显示该酶等电点为５．０。酶活力的最适ＰＨ为８．５,最适温度为３７℃,动力学实验提示该酶作用机理属于乒乓机制型。     

人肝谷胱甘肽过氧化物酶纯化及性质研究

经硫酸铵分级沉淀,离子交换层析和凝胶过滤等步骤,从人肝中获得了ＰＡＧＥ单一条带的谷胱甘肽过氧化物酶,比活提高１２０倍,得率为２５％。凝胶过滤法测得分子量为９０９８０,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定亚基分子量为２２４２３．原子吸收法测得每分子酶含有四个硒原子。等电聚焦显示该酶等电点为５．０．酶活力的最适ｐＨ为８．５,最适温度为３７℃。动力学实验提示该酶作用机理属于乒乓机制型。     

绿色糖单孢菌-木素过氧化物酶的纯化及酶学性质研究

实验以一株耐热耐碱放线菌--绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis)为研究对象,从其液体发酵产物中提取木素过氧化物酶(Lignin Peroxidases / LiP),粗酶液经硫酸铵分级沉淀、透析浓缩,最后经过Sephadex G-75柱色谱得到单一的LiP,酶纯度提高了11.06 倍;经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定该酶的分子量约为28.8kD.同时对纯酶的酶学性质进行了初步研究,发现LiP 酶的最适反应温度为50℃,最适反应为7.0 ;在75℃下具有良好的热稳定性,在pH7 ～ 10 范围内有较强的耐受力,保温30min 时酶的半衰期温度为75℃ ;该酶在高温、偏碱性的造纸工业中具有一定应用潜力.金属离子Cu2+、Fe2+、Co2+ 对酶具有明显促进作用,Ca2+、SDS 具有抑制作用;糖含量测定发现该酶为小分子量的糖基化蛋白,含有6.59% 的糖;酶动力学反应测定发现该酶对底物2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)的Km 值为0.1057mmol/L.     

微生物转谷氨酰胺酶的纯化方法和酶学性质研究

由Streptoverticillium mobaTaense发酵生产的转谷氨酰胺酶经过除茵体、超滤浓缩、乙醇沉淀、干燥后得到粗酶产品,其活力回收率约70％。又经Superdex-75凝胶过滤和Source 30S阳离子交换两步纯化后得到纯酶,最终酶活力收率约37％。酶最适温度为50℃,在40℃以下稳定性良好;最适pH为6．0,pH4．0～8．0时比较稳定。离子强度对酶影响很小。     

黑曲霉纤维素酶的纯化及酶学性质研究

黑曲霉(Aspergillusniger)固态发酵后粗酶液经硫酸铵盐析,2次SephadexG-200柱层析后可提纯8倍左右.CMC酶最适作用温度为60℃,最适作用pH为3.5,30℃～70℃区间酶活力较稳定,在pH3.0～5.0范围内,50℃保温30min能保持80%的酶活力.CMC酶的Km、Vmax值分别为7.69%CMCg/ml、0.33mg/ml·     

植酸酶的纯化及其酶学性质初步研究

从绿色木霉LH374固态发酵产物中提取植酸酶。粗酶液经硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析纯化后,提纯倍数可达13.3,回收率为27.1%。酶学性质研究表明,植酸酶最适作用温度为55℃、最适作用pH为6.0,米氏常数Km为0.15mmol/L。     

竹笋脚料过氧化物酶的提纯及酶学性质的研究

竹笋经加工成食品后,大量脚料被丢弃,严重浪费资源,污染环境.文中采用水抽提、硫酸铵分级沉淀、丙酮分级沉淀和CM-52离子交换层析三步法从竹笋脚料中快速提取并纯化该酶;同时对该酶部分的醇学性质(温度、pH时酶促反应的影响、酶的热稳定性、酸碱稳定性)进行了考查.结果表明经过纯化后的过氧化物酶的Rz值达到2.5,纯化倍数为12倍,回收率为28%.最适反应温度为55℃,最适pH为6.8,且其温度和pH的适用范围均较宽,热稳定性和酸碱稳定性均较高的中性同工酶.这些优越的酶学性质能为竹笋脚料过氧化物酶的应用提供依据.     

竹笋脚料过氧化物酶的提纯及酶学性质的研究

竹笋经加工成食品后,大量脚料被丢弃,严重浪费资源,污染环境。文中采用水抽提、硫酸铵分级沉淀、丙酮分级沉淀和CM-52离子交换层析三步法从竹笋脚料中快速提取并纯化该酶;同时对该酶部分的酶学性质（温度、pH对酶促反应的影响、酶的热稳定性、酸碱稳定性）进行了考查。结果表明经过纯化后的过氧化物酶的Rz值达到2．5,纯化倍数为12倍,回收率为28％。最适反应温度为55℃,最适pH为6．8,且其温度和pH的适用范围均较宽,热稳定性和酸碱稳定性均较高的中性同工酶。这些优越的酶学性质能为竹笋脚料过氧化物酶的应用提供依据。     

白灵侧耳漆酶分离纯化及其酶学性质研究

为了探索白灵侧耳Pleurotus eryngii var.tuoliensis漆酶性质,以白灵侧耳菌株00485为试验材料,从发酵液中分离纯化得到胞外漆酶并对其酶学性质进行测定。纯化流程依次为DEAE-Cellulose阴离子交换层析,CM-Cellulose阳离子交换层析,SP-Sepharose强阳离子交换层析以及Superdex 75凝胶过滤层析,获得胞外白灵侧耳漆酶(Pn Lac)。SDS-PAGE检测结果表明Pn Lac为65k Da的单一蛋白。Pn Lac经过胰蛋白酶水解得到3种肽段,经过NBCI-BLAST后发现它们与糙皮侧耳、环柄韧伞、刺芹侧耳等的漆酶具有同源性。底物为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)时该种漆酶的最适反应温度和p H分别为50℃和3.0,Ca2+和Hg2+能够抑制它的活性,相反地Cu2+和Mn2+能够提高它的活性,米氏常数Km和Vmax分别是0.17mmol/L和1.76OD/min/U。     

变色栓菌锰过氧化物酶同工酶的纯化及其性质研究

变色栓菌(Trametes versicolor)胞外产酶培养液经硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose DE52离子交换柱层析后,获得两个活性组分D1和D2,其中活性组分D2经Phenyl SepharoseTM6Fast Flow疏水层析后,所得样品MnP1经SDS-PAGE检测已达到电泳纯。活性组分D1经Phenyl SepharoseTM6Fast Flow疏水层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析后,所得样品MnP2经SDS-PAGE检测已达到电泳纯。两种同工酶MnP1及MnP2,各自的比活力为579.09、425.00U/mg;纯化倍数为17.51、12.85;活力回收率为6.17%、2.47%。由SDS-PAGE法测得MnP1及MnP2的表观分子量分别为46.3kD、43.0kD。两种同工酶催化DMP(2,6-二甲氧基酚)氧化反应的最适pH值及最适反应温度有所不同,最适pH值分别为pH5.8、pH6.2,最适反应温度分别为60℃、65℃。在45℃以下,pH4.0~7.0之间,MnP1及MnP2的稳定性好。DMP为最佳酶促反应底物,以DMP为底物的Km分别为13.43μmol/L、12.45μmol/L。在无Mn2 存在的条件下,酶促反应几乎不发生。EDTA在较高浓度时抑制酶的活性,DTT在所试浓度下都完全抑制酶的活性。     

枯草杆菌蛋白酶的纯化及酶学性质

本文利用实验室保存的枯草杆菌发酵产生枯草杆菌蛋白酶,并经(NH4)2SO4盐析和CM-sepharose Fast Flow对枯草杆菌蛋白酶进行纯化,用SDSPAGE检测纯化效果,显示该酶分子量低于14kDa,并对蛋白酶的酶学性质、体外溶栓特性及溶栓机理进行初步探讨,其最适反应温度为60-70℃,但50℃以下稳定性良好,最适反应pH为7,pH6-8稳定。     

链霉菌壳聚糖酶的纯化及其酶学性质

分离纯化从烟台近海土壤筛选的链霉菌来源壳聚糖酶,并对其酶学性质进行研究。通过(NH4)2SO4分级沉淀分离得粗酶,透析后经Sephadex G-100柱纯化,得到2种壳聚糖酶(ChA和ChB)。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Sephadex G-75凝胶过滤确定ChA的相对分子质量,研究ChA的最适底物水解条件、热稳定性、水解动力学及金属离子对酶活性影响。结果表明:ChA为单亚基蛋白,相对分子质量为4.16×104,在220和280 nm处呈现两个紫外吸收峰,催化水解壳聚糖的最适pH为5.0～5.5,最适温度为55℃。热稳定性实验表明:30℃温育1 h后酶活为初始酶活的33.3%,40℃温育1 h后酶活为初始酶活的22.2%。ChA的酶促反应初速率为6.2×10-3μmol/(mL.min),Vmax为0.318μmol/(mL.min),Km为1×10-2mg/mL,且对底物表现相对专一性。K+、Na+、Li+、Mg2+、Ca2+、Ba2+Zn2+、Cu2+和Co2+对ChA活力均表现为抑制作用,过渡金属离子Mn2+对酶有激活作用,重金属离子Hg2+、Ag+、Cd2+和Pb2+对酶均有较强的抑制作用。Mn2+和Zn2+的动力学研究表明,Mn2+对酶为混合型激活作用,Zn2+对酶为竞争性抑制作用。     

海洋来源琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究

采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,粗酶液经过中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析,得到一个电泳纯的琼胶酶组分Aga ZC-1,其分子质量约为45k Da,比活力为114.613U/mg。对Aga ZC-1进行酶学性质分析,结果表明,其最适反应p H为7.0,在p H为5.0~9.0时保温1h仍能保持80%以上的酶活力;最适反应温度为50℃,在45℃条件下保温1h酶活力保持在60%以上。在高浓度(5mmol/L)下,Fe~(3+)、Cu~(2+)、Sn~(2+)和Zn~(2+)能完全抑制琼胶酶的活性,在低浓度(1mmol/L)下,Cu~(2+)、Ba~(2+)、Na~+、Zn~(2+)、Ag~+、Sr~(3+)、K+对琼胶酶活性具有明显抑制作用。琼胶酶的动力学参数K_m和V_(max)分别为0.538mg/ml和6.33μmol/(L·min),对琼胶底物具有高度专一性,降解产物主要为新琼四糖和新琼六糖。     

毛栓菌漆酶的分离纯化及酶学性质研究

对毛栓菌产漆酶的分离、纯化及酶学性质进行研究。粗酶液经硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose柱层析,得到2种漆酶同工酶LacA和LacB。LacA和LacB回收率分别为17.1%和2.74%。SDS-PAGE电泳测得2漆酶的分子量分别为54.6 ku和7.7 ku;LacA和LacB最适作用温度分别为50℃和60℃;最适反应pH值分别为4.5和4.0;Cu2＋、Mg2＋对LacA有激活作用,对LacB影响不大;Ag＋对LacA和LacB表现为完全抑制;Fe3＋对LacA和LacB有一定的抑制作用;Ca2＋、Mn2＋、K＋、Na＋、Zn2＋对LacA和LacB影响不大。DTT、EDTA、DMSO、SDS对酶均有不同程度的抑制作用,且随其浓度的升高抑制作用增强。     

枯草芽孢杆菌中性植酸酶的纯化和酶学性质

从土壤中分离到了产中性植酸酶的枯草芽孢杆菌菌株并对所产植酸酶进行了分离纯化。此中性植酸酶的反应最适 pH为 7 5,最适温度为 55℃ ,在 37℃下以植酸钠为底物的Km值为 0 1 9mmol/L ,植酸酶活性依赖Ca2 +的存在。酶蛋白的分子量大小约为 45kD ,纯酶蛋白N端序列为Lys His Lys Leu Ser Asp Pro Tyr His Phe Thr。