氮源对灵芝菌丝体液态深层发酵合成灵芝三萜的影响

以沪农灵芝1号为供试菌株,葡萄糖作为碳源,用硫酸铵、氯化铵、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉作为氮源,研究不同种类氮源对灵芝菌丝体液态深层发酵过程的影响。首先,确定了N-10酵母自溶粉作为发酵的氮源,降低了发酵的复杂性和不确定性;其次,考察N-10酵母自溶粉不同浓度对灵芝菌丝体发酵合成灵芝三萜过程中菌丝体的生物量、葡萄糖消耗、灵芝三萜产量等方面的影响,确定了N-10酵母自溶粉的适宜添加浓度。在此基础上,采用响应面中心组合设计,对4因素最佳水平范围进行研究,结果表明,葡萄糖、N-10酵母自溶粉、磷酸二氢钾和七水硫酸镁的含量分别为31.06g/L、2.76g/L、1.77g/L和1.99g/L时,灵芝三萜的理论产量为21.166g/kg干菌丝体,实际发酵产量提高到21.153g/kg干菌丝体。与原工艺相比,新工艺的灵芝三萜产量提高了6.22%。     

pH对灵芝液态发酵代谢物及抗氧化活性的影响

已有研究报道灵芝栽培生长的最适pH在中性偏酸环境,在碱性范围的生长及代谢情况鲜见报道。本研究主要探究广泛pH对灵芝液态发酵代谢物及其抗氧化活性的影响。采用摇瓶液态培养后分析代谢物中灵芝三萜、胞内外多糖、菌丝体蛋白及抗氧化活性等指标,系统比较灵芝菌丝体在pH值2-11的生长和代谢情况。研究结果表明,灵芝菌丝体生长、合成灵芝三萜、胞内多糖、30E胞外多糖、菌丝体蛋白和菌丝体水解氨基酸的最适pH值分别为10、3、2、7、2和2。对应结果分别为17.13 g/L、33.86 mg/g、72.73 mg/g、7.86 g/L、71.42 mg/g和107.10 mg/g。比对照分别提高28.5%、77.3%、22.4%、96.5%、97.1%和70.8%。胞内多糖组分1和组分2最高分子量均在初始pH 4,分别为1.016×10⁸ g/mol和9.280×10⁴ g/mol,胞外多糖组分1最高分子量在初始pH 10,为4.946×10⁶ g/mol;对菌丝体的总抗氧化能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力、羟自由基清除能力分析结果表明最佳的初始pH分别为3、7、9。本研究为液态发酵方式下灵芝生长及其代谢物定向调控发酵的工艺优化提供参考依据,同时发现灵芝菌丝体中优质蛋白及抗氧化活性可在功能性食品和化妆品领域推广应用。     

灵芝三萜酸分批发酵的非结构动力学模型

研究了灵芝胞内和胞外三萜酸在30L发酵罐中分批发酵的动力学特征。利用Sigmoid函数构建了灵芝细胞生长、底物消耗、胞内和胞外三萜酸的非结构动力学模型,并根据Boltzmann拟合求解出各模型参数。结果表明,各模型预测值能够较好地吻合实验实测值。灵芝细胞比生长速率在第2.5天达到最大值（μmax）,为0.700d?1;葡萄糖比消耗速率在第2.4天达到最大值（qS, max）为1.060d?1;胞内三萜酸比合成速率在第4.7天达到最大值（qITA, max）为11.345mg/(g·d);胞外三萜酸比合成速     

油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺研究及规模化验证

灵芝三萜是灵芝中主要的活性成分之一,前期研究发现油酸可以促进灵芝三萜液态深层发酵下的发酵合成。本研究主要对油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺进行优化,并进行3L发酵罐规模的验证。通过单因素实验考察油酸的添加方式、添加时间和添加浓度对灵芝三萜的影响,结合响应面实验,获得最优工艺条件并进行验证：在发酵第32h添加1.21%高温灭菌油酸,最高灵芝三萜含量为42.69mg/g;在发酵第7h添加1.35%过滤除菌油酸,最高三萜含量为43.38mg/g,分别比对照提高2.04倍和2.08倍。在1 000mL摇瓶中添加高温灭菌油酸和过滤除菌油酸,灵芝三萜含量分别为32.18和32.48mg/g,为对照的1.96倍和1.95倍;在3L发酵罐规模下灵芝三萜含量分别为28.66和25.13mg/g,为对照的1.62倍和1.42倍。本研究系统优化了油酸促进灵芝三萜液态深层发酵的工艺条件,并在与工业生产相对应的3L发酵罐上进行验证。该研究可为灵芝三萜的规模化发酵提供重要参考和借鉴。     

复合有机氮源对灵芝三萜液态深层发酵的影响

以灵芝为材料,在前期研究基础上,以不同酵母粉作为氮源,研究复合有机氮源对灵芝三萜液态深层发酵的影响。首先,由单因素实验考察3种不同的酵母粉对灵芝菌丝体合成灵芝三萜的影响,确定酵母粉的最适宜浓度范围。在此基础上,根据中心组合实验设计,对3种酵母粉分别采用2种复合和3种复合的方式,优化复合有机氮源的最佳组合配比。结果表明：当基础培养基中添加6.6g/L的酵母粉N-1与6.6g/L的酵母粉N-2时,灵芝三萜产量可达0.478g/L（理论产量为0.485g/L）,比添加单一酵母粉N-1、N-2、N-3分别提高了21%、139%、103%,其氮源用量为两种组合时最低。当基础培养基中酵母粉N-1、N-2与N-3添加量分别为5.07g/L、3.78g/L、7.63g/L时,灵芝三萜产量达0.514g/L（理论产量为0.510g/L）,比单因素对照组分别提高了30%、157%和74%。本研究优化的复合氮源添加方式可明显提高灵芝菌丝体液态深层发酵生产灵芝三萜的产量,为其规模化液态深层发酵的生产提供科学数据。     

9,10-环甲基十七烷酸干预下灵芝深层发酵合成三萜酸的动力学特征

利用Sigmoid模型对比研究了添加9,10-环甲基十七烷酸（9,10-CMA）前后灵芝深层发酵产三萜酸的动态变化特征。研究显示,灵芝对照组中三萜酸在4-9d大量合成,并于第9天达到最大值（268.62mg/L）;添加9,10-CMA组中三萜酸的合成量于第8天时达到最大值（343.52mg/L）。添加9,10-CMA后,灵芝菌丝体细胞对底物葡萄糖的利用速度加快,细胞比生长速率在3.2天达到最大值（Μ_max）,为0.94d ^-1,显著高于对照组的0.88d ^-1（在第3.4天获得）;葡萄糖比消耗速率在第1.7天达到最大值（Q_{S, max}）,为8.34d ^-1,显著高于对照组的6.80d ^-1（在第2.1天获得）。胞内三萜酸比合成速率显著提高,在第6.2天达到最大值（Q_{ITA, max}）13.76d ^-1,是对照组9.66d ^-1的1.42倍。两组中灵芝三萜酸的合成与细胞生长均呈现部分偶联关系,添加9,10-CMA后,没有改变细胞生长和三萜酸合成在发酵过程中的相互关系。     

变转速策略调控灵芝菌丝体发酵高产三萜

灵芝发酵过程中,采用变转速调控策略,对振荡发酵阶段进行优化,以期达到高产三萜的目的。振荡阶段最佳条件为转速由150r/min变为100r/min,该策略与液体静置培养相结合,最终菌丝体三萜产量高达678.0g/L,比优化前提高了21%。振荡发酵阶段的变转速策略有效地提高了三萜的产量。     

响应面法优化灵芝菌丝体胞内灵芝酸的提取

利用单因子试验和响应面法优化了影响灵芝菌丝体灵芝酸的提取过程。基于3因素3水平的中心组合设计,得到了描述胞内灵芝酸提取得率与操作参数之间的二次响应面模型。在乙醇浓度为93.6%(v/v)、提取温度79.1℃、提取液固比42.2∶1、提取次数2次、每次提取时间2 h的条件下,最大灵芝酸理论提取得率为28.36 mg胞内灵芝酸每克干菌丝。模型优化条件下的实际灵芝酸提取得率(28.72 mg/g干菌丝)与理论灵芝酸提取得率(28.36 mg/g干菌丝)相符。     

赤霉素发酵溶氧优化调控研究

为了解溶氧对赤霉素发酵过程影响以及相应工艺优化,采用不同溶氧条件下藤仓赤霉菌Gibberella fujikuroi分批发酵生产赤霉素的过程进行菌丝浓度、残糖浓度和GA3产物浓度检测,并微分运算得出比生长速率与比产物合成速率随发酵时间变化,分析了溶氧对比生长速率与比产物合成速率以及得率的影响,进而提出Gibberella fujikuroi发酵高产的溶氧控制策略:在发酵初始阶段(0–50h)控制溶氧30%左右,以维持较高的菌体生长速率;发酵中后期(50–184h),溶氧控制在15%,以获取菌丝持续较高的GA3合成速率能力。采用这一优化溶氧控制策略,发酵过程中最大菌丝浓度19.24g/L、最终赤霉素浓度2 180mg/L和平均比产物合成速率0.616mg/(g·h),比未优化前发酵分别提高了8.33%、13.25%和4.58%,表明所采取的分阶段溶氧控制策略对促进GA3生产有效。     

药用昆虫蜣螂对灵芝发酵和抗小鼠肝癌活性的影响

采用液体深层发酵方式,研究了药用昆虫蜣螂对灵芝细胞生长、关键活性产物发酵动力学和抗小鼠肝癌活性的影响。结果表明,药用昆虫蜣螂在各添加浓度下对灵芝的细胞生长均无显著促进作用;但在添加量为5g/L时,对灵芝多糖和灵芝三萜的发酵动力学有显著影响(P<0.05),在发酵第7天时,灵芝总多糖和总三萜的产量分别达到2.81g/L和539.0mg/L(对照组分别为2.25g/L和428.2mg/L)。小鼠体内抗肝癌结果表明,灵芝对照发酵物的抑癌率为41.61%,灵芝-蜣螂配合物的抑癌率为42.24%;而补加蜣螂发酵后的灵芝加蜣发酵物的抑癌率高达57.21%,与灵芝对照发酵物的抑癌率相比,提高了37.49%。研究表明,采用昆虫蜣螂补料-分批发酵后,灵芝发酵物抗小鼠肝癌的活性得到显著增强。     

油酸对灵芝液态深层发酵合成羊毛甾醇代谢流分布的影响

通过代谢通量方法在3L搅拌式发酵罐上研究了油酸对灵芝液态深层发酵代谢终产物羊毛甾醇代谢流分布的影响。结果表明,在灵芝的液态深层发酵过程中,添加油酸使合成羊毛甾醇的代谢通量提高45.29%;副产物麦角甾醇的含量由3.84 mg/g降低至0.02 mg/g;羊毛甾醇合成途径(LP)、三羧酸循环(TCA)、磷酸戊糖途径(PP)和糖酵解途径(EMP)的代谢通量比对照组分别提高了29.09%、14.52%、12.22%和2.11%。因此,添加油酸能够加强灵芝液态深层发酵过程中的整体代谢流分布,减少副产物麦角甾醇的积累,提高羊毛甾醇的代谢流量。该研究为下一步灵芝液态深层发酵中灵芝三萜得率的提高奠定研究基础。     

基于UPLC-MS/MS定量检测法优化灵芝三萜热回流提取工艺的研究

基于超高效液相-三重四级杆质谱联用（UPLC-MS/MS）定量检测法优化出一种灵芝三萜热回流提取的工艺。通过本实验建立的灵芝三萜UPLC-MS/MS精确方法检测不同来源的7个栽培品种灵芝子实体中19个三萜化合物的含量,筛选出三萜含量较高的sd-2灵芝子实体作为提取原料,以三萜含量和提取物得率为指标,通过单因素和响应面实验对灵芝三萜的热回流工艺进行优化,获得的最佳条件为：乙醇浓度75%、提取时间2.5h、液料比14:1、提取次数2次。对获得的最佳提取工艺进行中试实验,灵芝子实体乙醇提取物的得率为6.10%,三萜含量为11.8591mg/g。研究结果可为灵芝三萜的工业大规模提取提供理论依据,为灵芝高附加值产品的开发利用提供技术支撑。     

灵芝线粒体及其对菌丝生长、主要活性成分影响的分析

线粒体是为细胞提供能量（ATP）的细胞器,携带着自己的DNA——mtDNA,已有多种灵芝属菌株的线粒体基因组相继报道,但对于种内的线粒体基因组的分析较少,对核相同、线粒体不同的菌株间差异的研究也鲜有报道。本研究对两株灵芝线粒体基因组进行组装注释,根据差异片段构建分子标记进行种间分类。结果显示：两株灵芝线粒体基因组大小分别为49 233bp、61 563bp的闭环结构,含有15个常见蛋白编码基因,rRNA大小亚基基因及26个携带氨基酸的tRNA基因,其差异区段主要为内含子序列、大亚基及基因间区。根据cob、cox2基因序列能够进行灵芝种间区分,用于灵芝种间鉴定。本研究还根据灵芝119、灵芝无孢的单核菌株构建同核异质体（TY-119、TY-W）,分析线粒体对菌落形态、菌丝生长速度及多糖、三萜成分的影响,结果显示：同核异质体TY-W与TY-119菌落形态上有一定差异,同核异质体TY-W菌丝生长速度为4.77mm/d,是TY-119菌丝生长速度4.50mm/d的1.06倍,同核异质体TY-119菌丝、子实体阶段多糖含量分别为4.45mg/g、12.14mg/g是TY-W菌丝体多糖含量（3.23mg/g）的1.38倍、子实体多糖含量（10.24mg/g）的1.19倍;同核异质体TY-W菌丝、子实体阶段的三萜含量分别为6.82mg/g、11.45mg/g是同核异质体TY-119菌丝体三萜含量（9.26mg/g）的0.74倍,子实体三萜含量（9.10mg/g）的1.26倍。利用高效液相色谱分析同核异质体中灵芝酸含量显示同核异质体TY-W灵芝酸A、灵芝酸E、灵芝酸F含量分别为3.77μg/mL、14.29μg/mL、12.91μg/mL;是TY-119灵芝酸A含量（2.59μg/mL）的1.46倍、灵芝酸E含量（13.65μg/mL）的1.17倍、灵芝酸F含量（12.72μg/mL）的1.06倍。对同核异质体菌丝、子实体阶段多糖、三萜合成通路关键基因（pgm、ugp、gls、hmgs、hmgr、mvd、fps、sqs）表达量进行检测,显示两菌株间多数基因具有显著性差异。结果表明线粒体的不同会影响灵芝菌落形态、菌丝生长速度及多糖、三萜的含量,有助于我们进一步研究线粒体基因组。     

法夫酵母分批发酵虾青素动力学研究

通过三联30L全自动发酵罐对虾青素产生菌法夫酵母的分批发酵动力学进行了研究,结果表明,法夫酵母的生长与限制性基质葡萄糖浓度之间符合Logistic方程,建立了细胞生长、产物合成和基质消耗随时间变化的数学模型。应用MATLAB软件对发酵动力学模型进行最优参数估计和非线性拟和,获得最大比生长速率（umax）和产物得率（Yp/x）分别为0.1829/h、0.1524g/g,虾青素分批发酵中细胞生长与产物合成属于偶联型,模型模拟计算结果和实验值能较好地吻合,动力学研究结果表明该模型能较好地反映细胞的生长、底物消耗和产物合成过程机制。     

灵芝液体浅层静置培养高效生产三萜的研究

三萜是灵芝Ganoderma lingzhi中重要的活性物质.本研究采用液体浅层静置培养方式(LSSC)提高灵芝三萜的产量.结果表明,在T25细胞培养瓶中的最佳培养条件为初始培养体积2mL,接种量7.0g(菌体湿重/L),在48h补加2mL培养液,发酵7d,三萜产量可达(32.95±0.51)mg/g,为摇瓶培养最高产...     

斯达氏油脂酵母利用混合糖发酵产油脂

研究了斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi2#利用葡萄糖-木糖混合糖为碳源生长和油脂积累特性。L.star-keyi2#利用70 g/L葡萄糖和70 g/L木糖作为碳源在30℃下摇瓶发酵96 h,糖利用率均达90%以上,菌体生物量分别为14.1 g/L和13.1 g/L,油脂质量分数分别为55.7%和52.6%。相同条件下该菌株利用混合糖(葡萄糖46 g/L,木糖24 g/L)为碳源时总糖利用率、生物量和油脂质量分数分别为75.1%,15.0 g/L和40.0%。借助于P lackett-Burm an设计法和单因子实验法对培养条件进行了优化,结果表明发酵96 h混合糖利用率可达到97.3%,发酵120 h后混合糖利用率、生物量和菌体油脂质量分数分别达99.5%、19.0 g/L和52.6%。生物量得率和油脂得率分别达到27%和14%。     

金龟子绿僵菌IMI330189液体发酵动力学研究

研究了金龟子绿僵菌IMI330189的液体发酵动力学。利用Sigmoid函数构建了该菌株液体发酵过程中的菌体生长和底物消耗的动力学模型,并运用Origin7.5软件拟合求解出各模型参数。结果表明,模型能够较好地拟合绿僵菌IMI330189液体发酵过程,其比生长速率在发酵第22.8h达到最大值,为0.084h-1;总糖比消耗速率在第9.6h达到最大值,为0.246h-1;总氮比消耗速率在第10.3h达到最大值,为0.007h-1;菌体对总糖的得率系数在39.8h达到最高,为0.861g/g。模型拟合和实验数据具有良好的适应性,基本反映了绿僵菌IMI330189液体发酵过程的动力学特征,为其液体发酵工艺的优化和发展奠定了基础。     

灵芝多糖液体发酵条件的研究

液体发酵灵芝是目前灵芝多糖开发的有效途径。以灵芝的生物量和胞外多糖为指标,对影响灵芝发酵的条件进行了研究。单因素实验表明灵芝发酵的最佳碳源、(?)源和生长因子分别是葡萄糖、酵母膏和维生素B1,最适温度、起始pH值和摇床转速分别是28℃、5．5和160 rpm。最佳培养方式是接种后静置4 h再振荡培养,其生物量和胞外多糖的产量最高,分别为7．743g/L和0．907g/L。     

外源物质对灵芝多糖和β-葡聚糖发酵的影响

研究了14种外源物质（化合物）对灵芝细胞生长和发酵合成多糖和β-葡聚糖的影响。结果表明,连翘水提物（3g/L）对灵芝细胞生长具有显著促进作用;薏苡仁酯（3g/L）对灵芝胞内多糖和β-葡聚糖的合成均具有促进作用;而桔梗水提物、硝酸铈铵、硝酸镨、茉莉酸甲酯和硝普钠对灵芝细胞生长和产物合成均具有抑制作用。进一步通过Box-Behnken试验设计和响应面法分析,建立了添加薏苡仁酯发酵产β-葡聚糖的二次多项式模型,经分析得到产β-葡聚糖的最优条件为：薏苡仁酯添加量10.5g/L、接种量16%、添加时间第88小时、发酵初始pH 7.00。在此条件下获得β-葡聚糖的产量可达(40.67±8.43)mg/L,与未添加薏苡仁酯的对照组相比,提高了41.86%;多糖产量为(0.99±0.21)g/L,与对照组相比,提高了31.99%。结果提示所得添加薏苡仁酯的优化条件可定向诱导灵芝β-葡聚糖的合成,同时也表明在灵芝液体发酵体系中添加薏苡仁酯发酵产多糖和β-葡聚糖具有一定的实用价值。     

树干毕赤酵母NLP31发酵产乙醇的研究

研究了树干毕赤酵母NLP31在木糖质量浓度为45 g/L的3种发酵培养基Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ上发酵3轮的发酵性能以及在45 g/L木糖或混合糖(葡萄糖30 g/L,木糖15 g/L)的发酵培养基Ⅲ上的代谢历程。结果表明:树干毕赤酵母NLP31在发酵培养基Ⅲ上,乙醇浓度和乙醇得率均达到最高,分别为(17.29±0.15)g/L和(84.65±0.58)%。在45 g/L木糖或混合糖(葡萄糖30 g/L,木糖15 g/L)的发酵培养基Ⅲ上的代谢历程表明:混合糖发酵达到最大乙醇得率的时间仅为12 h,要比单一木糖发酵缩短了8 h。树干毕赤酵母NLP31在以廉价的无机N源为发酵培养基上的乙醇发酵性能高,能够降低燃料乙醇的生产成本。