重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定北大核心CSCD

纤溶酶在溶栓治疗中起重要作用,能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白。采用RACE方法从海蚯蚓消化道组织中扩增出海蚯蚓纤溶酶编码序列,构建该基因原核表达载体,并进一步构建工程菌表达融合蛋白,经Ni2+树脂柱纯化后通过平板法检测该融合蛋白纤维蛋白酶原激活活性。结果获得海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并成功构建重组表达载体p ET-21a-AFE,表达纯化出融合蛋白,该融合蛋白能够激活纤维蛋白酶原而溶解纤维蛋白。总之,本研究获得了海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并初步证明其具有纤维蛋白酶原激活活性,为临床新型溶栓药物的开发提供实验基础。     

蚯蚓纤溶酶基因(Efp-Ⅰ)在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolyti cenzyme,EFE)基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因(GenBank,DQ418454)。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白(MBP-EfP-Ⅰ)。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。     

蚯蚓纤溶酶基因P239的原核表达、纯化及活性测定

通过RT-PCR方法从蚯蚓(Lumbricus bimastus)中获得蚯蚓纤溶酶基因,命名为P-239,含有 852 个核苷酸,成熟肽编码 239 个氨基酸,通过Genbank 序列同源性比较,与已知的蚯蚓纤溶酶有一定的同源性,为首次获得的新基因.随后构建了pBV-220/P-239重组质粒,在大肠杆菌DH5α中进行原核表达,再经亲和层析柱纯化复性,其产物经活性测定,确定不仅具有激酶作用,而且具有直接溶栓活性.     

蚯蚓纤溶酶基因（Efp-Ⅰ）在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme,EFE）基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因（GenBank,DQ418454）。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白（MBP-EfP-Ⅰ）。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。     

蚯蚓纤溶酶基因的克隆与序列分析

目的:获取蚯蚓纤溶酶(EFE)的基因,并对其进行序列分析。方法:从赤子爱胜蚓中提取总RNA,然后利用RT-PCR技术扩增EFE的基因,并将其插入pUCm-T载体,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定及分析。结果:DNA序列分析表明,所克隆的EFE基因全长为738bp,其中编码区段为735bp,共编码245个氨基酸残基,成熟肽为238个氨基酸残基。与GenBank中已报道的粉正蚓的EFE序列F-Ⅲ-2的同源性最高,两者在核苷酸序列上有2处不同,即第137位(T→C)和第632位(G→T),密码子也因而分别由GTC、GGT变为GCC、GTT,导致第46位、211位的氨基酸残基分别由缬氨酸、甘氨酸变为丙氨酸和缬氨酸。结论:从赤子爱胜蚓中成功克隆了1条EFE基因F245。序列测定及同源性分析表明,蚯蚓纤溶酶F245与已报道的多条EFE基因序列具有高度同源性,且具备完整的编码区。该序列的克隆为用基因工程的方法生产单一成分的高酶活性EFE奠定了基础。     

蚯蚓纤溶酶基因（Efp-Ⅰ）在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme,EFE）基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因（GenBank,DQ418454）。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白（MBP-EfP-Ⅰ）。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。     

纤溶酶产生菌—藤黄微球菌的筛选、鉴定及纤溶酶基因的克隆

通过血粉培养基富集、纤维蛋白培养基筛选,从自然环境中分离到一株纤溶酶产生菌,命名为ML909.利用传统细菌分类鉴定方法对其形态和生理生化特征进行了研究,发现其与藤黄微球菌的特征相符,16S rDNA序列分析的结果也表明它与藤黄微球菌的16S rDNA序列的同源性高达99%,因此该茵在系统分类学上属于微球茵属(Micrococcus Cohn)藤黄微球菌(Micrococcus luteus).通过PCR方法对其纤溶酶的编码区序列进行了克隆和序列分析,基因登录GenBank,登录号为EU232121.     

蚯蚓纤溶酶分子生物学进展

蚯蚓纤溶酶是近年发现的一种新型的溶解血栓物质,属丝氨酸蛋白酶,不同种属的蚯蚓中均可分离到,具纤溶活性和溶栓活性。有较好的热稳定性,多为单体酶,多数兼有纤溶活性和纤溶酶原激活活性。不同种属的蚯蚓分离的纤溶酶性质上有一定差别。已获得多种纤溶酶的N端序列及部分核酸序列,相互之间及与某些蛋白酶之间有一定的同源性。纤溶酶通过降解目的蛋白的特定位点而起作用 。     

蚯蚓纤溶酶底物特异性

蚯蚓纤溶酶是具有较强溶栓作用的丝氨酸蛋白酶,为研究蚯蚓纤溶酶在溶栓的同时是否对其他血液蛋白有破坏作用,本实验以一些血液功能蛋白为底物,用蚯蚓纤溶酶在体外对其进行水解,采用SDS—PAGE检测水解前后底物成分的变化。结果显示,蚯蚓纤溶酶短时间内能完全水解纤维蛋白和纤维蛋白原,长时间作用下能部分水解牛血清白蛋白和人免疫球蛋白重链,不水解牛血红蛋白、牛血超氧化物歧化酶和牛凝血酶原。表明蚯蚓纤溶酶对血栓成分具有较强的识别和水解能力,而对其他血液蛋白作用微弱,说明蚯蚓纤溶酶作为药物使用时具有较强的溶栓和预防血栓形成的作用,且副作用较小。     

蚯蚓纤溶酶分子生物学进展

蚯蚓纤溶酶是近年发现的一种新型的溶解血栓物质,属丝氨酸蛋白酶,不同种属的蚯蚓中均可分离到,具纤溶活性和溶栓活性。有较好的热稳定性,多为单体酶,多数兼有纤溶活性和纤溶酶原激活活性。不同种属的蚯蚓分离的纤溶酶性质上有一定差别。已获得多种纤溶酶的N端序列及部分核酸序列,相互之间及与某些蛋白酶之间有一定的同源性。纤溶酶通过降解目的蛋白的特定位点而起作用。     

蚯蚓纤溶酶组分的抗原性

以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基 ,通过亲和层析制备出的蚯蚓纤溶酶 (EFE)含有 11～ 13个组分 .为了了解这些组分的相互关系 ,用EFE免疫家兔获得了抗血清 .利用该抗血清与已纯化的 10个组分进行免疫双扩散 ,根据形成沉淀线的形状可以将上述 10个组分分为 4大组 .各组内组分之间的沉淀线完全融合 (免疫反应同一性 ) ;组间沉淀线交叉 (免疫反应非同一性 )或为支线 (免疫反应部分同一性 ) .这种按免疫学性质分组与根据分子量大小、氨基酸组成和N端氨基酸序列分组基本吻合 .上述结果为EFE的分类提供了依据 .     

蚯蚓纤溶酶的成分分析

蚯蚓纤溶酶（ｅａｒｔｈｗｏｒｍｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓ,ＥＦＥ）是从蚯蚓体内提取的一类纤维蛋白水解酶,是一种新的溶栓药．利用亲和层析技术,自蚯蚓匀浆液一步提取蚯蚓纤溶酶,并对该酶的成分进行了分析．实验表明,蚯蚓纤溶酶是一组非均一的糖蛋白,含糖量为５％左右,以中性已糖为主;等电点（ｐＩ）在４．０以下;富含Ａｓｐ,而Ｍｅｔ、Ｔｒｐ和Ｌｙｓ含量很少;ｌｍｇ蚯蚓纤溶酶相当于２５０～３００尿激酶单位．     

蚯蚓纤溶酶新基因PV242的克隆与表达

从我国特有的双胸蚓属（Lumbricus bimastus）蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质,采用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)微量测序法测得蛋白质的N端氨基酸序列,依此设计简并引物,通过RT-PCR获得其对应cDNA.该cDNA全长888 bp,1～726位核苷酸对应读码框架(ORF),编码含242个氨基酸的成熟肽.终止子（TAG）位于cDNA的727～729位,其余核苷酸序列为3′端非编码区.成熟肽命名为蚯蚓纤溶酶PV₂₄₂.蛋白质预测得知蛋白质等电点为4.33,含组氨酸(His44)及丝氨酸 (Ser191)两个活性位点;蛋白质由两个结构域组成,表面有活性裂隙;该蛋白质属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类.经国际基因库等多种查询比较未见PV₂₄₂基因的报道,为首次发现的新基因,在国际基因库的输入号为GenBank AF109648.随后构建了pTrxFUS-PV₂₄₂重组质粒,并在大肠杆菌GI724中获得融合蛋白TrxA/PV₂₄₂的可溶性表达,采用离子交换层析法纯化表达蛋白,融合蛋白有纤维平板溶解活性.     

蚯蚓纤溶酶的纯化及稳定性研究

蚯蚓纤溶酶（ＥＰＡ）抽提液经３０％ ～７０％ 饱和度的（ＮＨ４）２ＳＯ４ 盐析、ＤＥＡＥ—纤维素柱层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５葡聚糖凝胶过滤等纯化步骤,得到了具有纤溶活性的洗脱峰,置凝胶电泳后,得到四个活性组分,它们经５０℃保温６ｈ,活力上升６４％ ;在２ ｍ ｏｌ／Ｌ盐酸胍存在时,活力仅保存７．２％ ,当其浓度降低时,活力可恢复至９０％ ;在１％ ＳＤＳ存在时,活力仅保存１２．１％ ,但当ＳＤＳ除去时,活力又可恢复。因此,盐酸胍、ＳＤＳ均为ＥＰＡ 可逆性抑制剂。另外,ＥＰＡ 中含有较高的糖链（占总量的４５％ ）,具有良好的抵抗自水解作用。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质邢宝东殷慎敏茹炳根（北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系,北京１００８７１）关键词蚯蚓;纤溶酶;纤维蛋白收搞日期：１９９７－０１－２１;接收日期：１９９７－０３－２７。蚯蚓作为中药已有悠久历史,许多中医都把它作为活血药...     

蛇毒纤溶酶Alfimeprase在毕赤酵母中的优化表达及活性鉴定

摘要 Alfimeprase(ALF)是蛇毒纤溶酶Fibrolase的N端突变体,有纤溶活性而无出血活性。通过双酶切从克隆载体上获取目的基因alf,并将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZα A,经高效电转化、Zeocin筛选鉴定及培养条件pH、每天甲醇流加终浓度、菌体生长密度和甲醇诱导时间的优化,获得了重组ALF(rALF)高表达菌株pPICZ? A-alf / GS115,且在优化条件下rALF的最高产量达425 mg/L。通过His•bind柱纯化后,rALF纯度高达95 %,SDS-PAGE和Western blot分析表明rALF的分子量约为24 kDa,且能与一抗特异结合。纤维蛋白平板法纤溶活性鉴定结果进一步说明rALF获得了高活性分泌表达。这即为ALF的深入研究和工业化生产应用奠定了重要基础。     

蚯蚓纤溶酶的糖成分分析

以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析制备的蚯蚓纤溶酶是一组糖蛋白。通过苯酚一硫酸法测中性糖,3,5一二硝基水扬酸法测还原糖,硅胶G薄层层析法鉴定糖的种类,结果为：蚯蚓纤溶酶主要含有中性己糖,含量为15％左右,TFMS的去糖处理会使蚯蚓纤溶酶酶活丢失．     

蚯蚓纤溶酶组分的抗原性分析

  用热变性蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolitic enzyme,EFE)组分EfP-0-2、EfP-Ⅰ-1、EfP-Ⅱ-1, 以及重组蛋白EfP-Ⅲ-2为抗原,免疫家兔获得了抗血清,利用获得的抗血清对部分组分的免疫学同一性进行了验证.EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ的免疫双扩散反应表明,EfP-Ⅰ和EfP-Ⅱ具有部分免疫学同一性. 利用DNAMAN软件对获得的EfP-0、EfP-Ⅰ、EfP-Ⅱ、EfP -Ⅲ的蛋白质序列进行了初步分析,包括整个序列相似性比对、氨基酸组成、蛋白酶消化、抗原肽、疏水性和亲水性轮廓等,并对N端氨基酸序列进行了分析.结果表明,EfP-Ⅰ和EfP- Ⅱ具有部分免疫学同一性是由它们蛋白质序列的组成和结构决定的.     

人微小纤溶酶基因的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增人微小纤溶酶原（Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍｉｎｇｅｎ,ｍＰｌｇ）基因,再与表达戴本重组,构造ｍＰｌｇ原核表达质粒并转化大肠杆菌,阳性克隆ｐＳＳＥ－ｍＰｌｇ经温度诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等方法证明表达产物的分子量约为２９ｋＤａ占全菌总蛋白的２４％左右,并在菌内形成包涵体,经半胱氨酸再氧化法和空气氧化法复法,表达产物的ｒ－ｍＰｌｇ经ＳＫ作用后显示纤溶活性。同时对蛋白质浓度,复性时间等因素对     

重组人纤溶酶原基因的酵母表达、产物纯化及鉴定

目的: 研究重组人纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域（rhPLG-SP）的酵母表达、纯化及理化性质。 方法:采用7.5 L发酵罐对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌 rhPLG-SP/GS115 进行高密度培养、甲醇诱导表达rhPLG-SP,培养液经三步纯化：超滤、Sephacryl S-100、SP-Sepharose FF,将活性组分透析后冷冻干燥。等点聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测 rhPLG-SP等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S-2403 分别测定 rhPLG-SP激活后的纤维蛋白溶解和酰胺水解活性。结果: 7.5 L高密度发酵可获得约为400mg/L培液的表达量,经三步纯化后制备的rhPLG-SP纯度大于96%。理化分析显示 rhPLG-SP的等电点为7.5~7.8,分子量：27 877 Da,比活性：23.6U/mg。结论: 初步建立了rhPLG-SP酵母工程菌的高密度培养、表达及纯化工艺,所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近,具备放大生产和应用的潜力。