番木瓜环斑病毒单克隆抗体的制备及在病毒分型上的初步应用

本试验是用番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRV)提纯制剂免疫的BALB/c小白鼠脾细胞与Sp~2/o-Ag14骨髓瘤细胞融合,获得三个能稳定传代并分泌抗番木瓜环斑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中23H1 McAb的效价较高,用ELISA检测,腹水抗体效价高达1:76800,能被PRV兔抗血清所阻断。这3个杂交瘤细胞系产生的单抗与TMV和CMV无血清交叉反应。它们可把PRV四个毒株初步区分为三个血清型。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备

以纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)为抗原,注射免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,经多次细胞筛选及克隆化,获得3株(A8、B7和G9)可分泌抗ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以之分别制备小鼠腹水单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验检测表明,该3株杂交瘤细胞腹水抗体效价在10-5～10-6之间,且均具有与ToRSV反应的特异性。     

番木瓜环斑病毒在番木瓜原生质体中复制的初步研究

以1.0％的Macerozyme R—10,1.5％的Cellulose Onozuka R—10,0.45mol/L的甘露醇和pH5.4的培养基作为分离番木瓜原生质体的最佳条件,得到了高活力和高产量的原生质体。PRV-Ys(Vb)株系和聚鸟氨酸(PLO,WW200000)分别以1μg/ml的最终浓度接种番木瓜原生质体(5×10~6原生质体/ml),成功地建立了PRV—番木瓜原生质体体系。对于PRV在番木瓜原生质体中复制的行为动态差异,本实验研究了PRV-Ys和PRV-Vb两株系,三个不同抗性梯度的番木瓜原生质以及不同培养温度之间相互作用,相互影响的关系,从而认为PRV不仅能在寄主品种Carica papaya var,F1和C.papaya var.Tw-5而且还能在非寄主C.stipulata的原生质体中进行增殖;环境温度不仅能影响PRV在番木瓜细胞中的增殖能力,而且还能影响植株细胞本身的生活能力和抗PRV侵染的能力;PRV-Ys和PRV-Vb两株系在C.papaya var.F1原生质体中的增殖潜伏期和增殖曲线没有明显差异。     

番木瓜环斑病毒（PRV）提纯的研究

番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）提纯的研究高文通（黄埔动植物检疫局，广州５１０７００）高乔婉，范怀忠（华南农业大学植保系，广州５１０６４２）关键词番木瓜环斑病毒，病毒提纯四十年代末，美国首次报道的番木瓜环斑病（ＰａｐｅｙａＲｉｎｇｓｐｏｔＶｉｒｕｓ，ＰＲＶ）...     

番木瓜环斑病毒检测技术的研究

本研究在37℃条件下,以硝酸纤维素滤膜(NCM)为载体:3％酪蛋白为封闭剂、辣根过氧化物酶标记的A蛋白为酶标结合物(SPA-HRP)和以稀释100倍兔抗PRV-Ys的IgG为其工作浓度,成功地建立了检测PRV的间接Dot-ELISA。其检测灵敏度达到了较满意的ng水平。同时,本研究以PRV-Ys株系RNA作模板、oligo(dT)~(12-18)作引物、pUC19作cDNA克隆载体和以E.coli JM107作受体,采用缺口翻译(Nick Translation)方法成功地制备了pYs6 cDNA分子探针(插入片段约300bp)。其检测PRV-RNA的灵敏度达到了较理想的pg水平。     

番木瓜环斑病毒弱株系保护作用的研究

本文报道了在番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）弱株系保护作用中,保护接种与攻击接种的深度,以及攻击接种的部位等因素对ＨＡ５－１弱株系保护作用效果的影响结果。通过分析弱株系和强株系在保护接种后攻毒的植株体内的病毒浓度,表明ＨＡ５－１弱株系对Ｓｍ株系的保护作用的崩溃是由于强株系在植株顶端叶片听病毒浓度越来越高所致。本文还就ＰＲＶ弱株系在田间的应用技术作了一些讨论。     

番木瓜抗病突变体阻碍环斑病毒体内运转

应用RT－PCR一步法检测了PRSV Ys株系在感病番木瓜及其抗病突变体植株体内的运转动态,结果表明：在感病植株中,接种后48hr接种叶的未接种部位可检出病毒,第4天部分接种叶柄可检出病毒,第6天植株各部位均能检出病毒;而在抗病植株中,接种后可以而且仅能在接种部位检出病毒;因而认为抗病突变体能够阻碍病毒从接种部位运出及（或）向未接种部位运入。     

番木瓜抗病突变体阻碍环斑病毒体内运转

应用RT-PCR一步法检测了PRSVYs株系在感病番木瓜及其抗病突变体植株体内的运转动态,结果表明在感病植株中,接种后48hr接种叶的未接种部位可检出病毒,第4天部分接种叶柄可检出病毒,第6天植株各部位均能检出病毒;而在抗病植株中,接种后可以而且仅能在接种部位检出病毒;因而认为抗病突变体能够阻碍病毒从接种部位运出及（或）向未接种部位运入。     

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT－PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒（PMaLV）的外壳蛋白（CP）基因,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System（简称T－载体）,并进行了序列分析。结果表明,PMaLV CP基因核苷酸序列全长为861nt,推导其编码287个氨基酸。与番木瓜环斑病毒（PRSV）美国夏威HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比,在第66nt处开始连续缺失3个核苷酸。与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比,其CP基因序列同源率分别为96％、98％、95％、89％和89％。其的氨基酸序列同源率分别为98％、97％、97％、96％和95％。此结果表明,PMaLV属于PRSV的一个株系,不是一种新病毒。因此,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系（ML株系）。     

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT-PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒(PMaLV)的外壳蛋白(CP)基因,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System(简称T-载体),并进行了序列分析.结果表明,PMaLVCP基因核苷酸序列全长为861nt,推导其编码287个氨基酸.与番木瓜环斑病毒(PRSV)美国夏威夷HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比,在第66nt处开始连续缺失3个核苷酸.与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比,其CP基因序列同源率分别为96%、98%、95%、89%和89%.其推导的氨基酸序列同源率分别为98%、97%、97%、96%和95%.此结果表明,PMaLV属于PRSV的一个株系,不是一种新病毒.因此,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系(ML株系).     

番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究

建立了检测番木瓜环斑病毒 (PRV)的免疫捕捉 PCR (IC PCR)法、ELISA PCR法和巢式 PCR法 ,它们分别能从 10 - 4、10 - 7和 10 - 14 稀释度的番木瓜叶粗汁液 (所含鲜叶组织的量分别 0 .5ug、0 .5ng和 5× 10 - 6ng)中检测出PRV。     

云南番木瓜环斑病毒的发生及遗传多样性

【目的】明确云南省番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)发生情况,并对其进行遗传多样性分析。【方法】利用RT-PCR技术,于2011-2012年对采自云南省昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州、文山州等地的24个番木瓜、南瓜和罗汉果疑似病样进行扩增、测序,对样品中获得的940 bp PRSV部分cp基因及3′端非编码区的序列应用分子生物学软件MEGA 5进行系统发育分析。【结果】从17个样品中检测到了PRSV,检出率为70.8%,表明该病毒在云南的发生较为普遍。云南PRSV不同分离物间的核苷酸序列变异较大,与其他已报道的PRSV分离物之间的基因组3′端核苷酸序列一致性为81.7%-100%。基于PRSV的CP部分氨基酸序列及基因组3′端核苷酸的系统进化分析结果表明,来自亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲的PRSV分离物可以分为2个组,其中第Ⅰ组均为来自中国的分离物,包括了大部分的PRSV云南分离物,第Ⅰ组内分离物间的差异较第Ⅱ组大;第Ⅱ组的分离物来源较为复杂,亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲均有分布。基于PRSV CP部分氨基酸序列构建的系统进化树中,各分离物之间没有明显的地理和寄主相关性,而基于PRSV基因组3′端核苷酸序列构建的系统进化树中,除中国大陆分离物和印度分离物外,其他地区的PRSV在进化上与其地理来源有明显的相关性。【结论】PRSV在云南的昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州和文山州等地都有不同程度发生,且为害寄主植物涉及番木瓜、南瓜及罗汉果,PRSV侵染罗汉果为云南首次发现。云南PRSV分离物的分子变异很大,但是关于PRSV的分子变异是否与其地理分布及症状表现有关,以及P型和W型的分子区分特征还有待进一步研究。     

番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究

建立了检测番木瓜环斑病毒(PRV)的免疫捕捉-PCR(IC-PCR)法、ELISA-PCR法和巢式-PCR法,它们分别能从10-4、10-7和10-14稀释度的番木瓜叶粗汁液(所含鲜叶组织的量分别0.5ug、0.5ng和5×10-6ng)中检测出PRV.     

番木瓜环斑病毒株系,分子生物学及其防治研究进展

番木瓜环斑病毒株系、分子生物学及其防治研究进展肖火根，范怀忠（华南农业大学植物病毒研究室，广州５１０６４２）ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅＳｔｒａｉｎｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｏｆＰａｐａｙａＲｉｎｇｓｐ...     

番木瓜环斑病毒海南分离株全基因组序列分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus)的成员之一.病毒粒体呈线状,长700～900nm,直径为12.5nm.为单分体正链RNA病毒,由多种蚜虫以非持久方式传播.依寄主范围可划分为P型和W型两种.其中P型株系(PRSV-P)是制约生产的重要病原,除了给番木瓜生产带来严重危害,也会危害葫芦科作物.W型株系(PRSV-W)是危害葫芦科作物的主要病原,虽然和PRSV-P型株系血清学反应密切相关,但不侵染番木瓜.     

植物组织粗汁液中的番木瓜环斑病毒的ELISA检测技术

本研究建立和改进了检测番木瓜和西葫芦组织粗汁液里的番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）的ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法。用不同的ＥＬＩＳＡ方法来检测不同寄主植物粗汁液里的ＰＲＶ,其所用的合适的制备粗汁液的缓冲液是不同的。用ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法检测西葫芦粗汁液时,以０．５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．５,内含０．１ｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸二钠）为宜;而检测番木瓜粗汁液时,则还要加入０．２５ｍｏｌ／Ｌ脲。用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法检测时,在上述磷酸盐缓冲液中加入２％聚乙烯吡咯烷铜能提高对西葫芦粗汁液的检测效果。应用合适的制备粗汁液的缓冲液,ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法的灵敏度分别提高到１／４０９６和１／１０２４（稀释度）。本研究还表明,影响ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法的定过测定的主要因素是粗汁液的稀释度和包被液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ碳酸盐缓冲液,ｐＨ９．６）的用过。在较高粗汁液稀释度和包被液的用量相同时,粗汁液里的病毒含量与ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ法的ＯＤ４９２ｎｍ值呈真实的线性关系。     

齿兰环斑病毒的鉴定及其抗血清的制备与应用

根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质等初步确定从在厦门地区种植的表现为褪绿、褐色坏死斑症状的卡特兰(Cattleya)病株上分离的一个病毒分离物为齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspotvirus,ORSV)。通过摩擦接种6科27种(或品种)指示植物,结果其中4科8种(或品种)表现症状,与烟草花叶病毒不同;理化性质试验表明稀释限点为5×10-5,致死温度为92℃～94℃,体外存活期超过3个月。提纯病毒为长约300nm,宽约18nm杆状粒体。SDS-PAGE电泳分析表明其外壳蛋白分子量约为17kDa。该分离物与ORSV抗血清具有强阳性反应、而与TMV抗血清反应微弱,认为该病毒为ORSV分离物。用纯化病毒免疫家兔,成功地制备出特异性抗血清,并通过Dot-ELISA法对厦门地区种植的兰花病株进行了检测研究。