核受体PPARγ结合小肽的筛选及其功能

为筛选与核受体过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)结合的功能短肽,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达PPARγ配体结合域(LBD)的融合蛋白,并利用Ni2+-NTA离子交换树脂对表达蛋白进行纯化.以此纯化蛋白为靶,采用固体包被法对噬菌体展示随机十二肽库及环七肽库进行亲和筛选.经ELISA法鉴定特异结合的高亲和力阳性噬菌体单克隆并测序.同时利用PPARγ的配体rosiglitazone与噬菌体小肽进行竞争性结合抑制实验.最终获得与PPARγ-LBD高亲和力的十二肽3个,环七肽5个,分别含LXXLL和DXXRW(其中X为非特异氨基酸残基)保守序列.Rosiglitazone不影响噬菌体小肽与靶蛋白的结合,说明获得与配体rosiglitazone结合位点不同的目的肽.     

细胞核受体LXRβ的体外酶标测活方法的建立与应用

目的:克隆并表达大鼠细胞核受体LXRβ配体结合区(LBD)序列,并进行配体依赖性受体与共激活因子结合区短肽相互作用的酶标法分析,建立简易经济可靠的体外高通量筛选LXR调节剂方法.方法:从含大鼠LXRβ cDNA序列的pSG5/rLXRβ上扩增LBD区序列,测序核实序列后,将此序列克隆入表达载体,构建原核表达载体pET28a(+)-rLXRβ-LBD;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting检测及Ni2+亲和层析柱分离纯化;建立ELISA方法检测配体依赖性受体-共激活短肽相互作用.结果:重组蛋白rLXRβ-LBD在大肠杆菌中高效表达(占菌体总蛋白30%),SDS-PAGE显示在36kDa处有免疫特异性蛋白,纯化后全长蛋白占90%以上.ELISA结合测试显示在激动剂猪脱氧胆酸二甲酰胺存在时,rLXRβ-LBD能与共激活短肽结合,亲和力与双荧光酶报告基因测活结果吻合.结论:成功克隆并表达rLXRβ-LBD序列,建立起ELISA筛选方法,为LXR-LBD配体功能活性的研究和配体的高通量筛选提供新方法.     

根癌农杆菌化学受体MCP1912调节趋化响应功能的鉴定

【目的】本研究以根癌农杆菌C58为材料,鉴定其甲基趋化受体蛋白（methyl-accepting chemotaxis protein,MCP） MCP₁₉₁₂能够识别的配体,并研究该蛋白在调控根癌农杆菌趋化响应中的具体功能。【方法】通过异源表达MCP₁₉₁₂的配体结合结构域（ligand binding domain,LBD）,获得带有His标签的LBD蛋白(LBD₁₉₁₂)。利用基于荧光的热位移测定法（fluorescence-based thermal shift assay,TSA）筛选出LBD₁₉₁₂的潜在配体;通过等温滴定量热（isothermal titration calorimetry,ITC）,进一步确定筛选出的潜在配体,并测定LBD₁₉₁₂与配体结合之后的解离平衡常数K_D。利用基于同源重组的精准DNA片段删除方法,敲除根癌农杆菌C58中编码MCP₁₉₁₂的基因atu1912,获得MCP_{1 912}     

孕烷X受体配体结合结构域蛋白晶体的X线衍射结构解析

目的:利用X线衍射技术解析孕烷X受体(PXR)配体结合结构域(LBD)蛋白晶体的3维结构。方法:对PXR蛋白LBD(130~434氨基酸残基)序列进行密码子优化并化学合成后克隆至pRSFDuet-1表达载体,再将载体导入大肠杆菌BL21(DE3),对PXR-LBD蛋白进行原核表达与分离纯化;采用晶体筛选试剂盒筛选蛋白结晶条件,采用悬滴法获得目标蛋白的晶体;对获得的蛋白晶体进行X线晶体衍射检测,并收集相关数据建立PXR-LBD的三维结构。结果:获得了PXR-LBD的高质量晶体并利用X线衍射解析了该蛋白质晶体的结构数据,使用Phenix.refine软件和COOT软件等对结构进行修正,最终获得了高分辨率的3维结构数据。结论:完成了孕烷X受体配体结合结构域蛋白晶体的X线衍射结构解析,为研究和开发PXR相关药物奠定了基础。     

小鼠丝氨酸消旋酶的克隆、表达与纯化

丝氨酸消旋酶(Serine Racemase,SR)是一种磷酸吡多醛依赖酶,在ATP和Mg2+的辅助下,催化L型丝氨酸转变为D型丝氨酸,D-丝氨酸通过结合在NMDA受体的Gly结合位点,调节其生理功能。本文将小鼠来源的丝氨酸消旋酶基因克隆至原核表达载体pMAL-C2上,构建重组质粒pMAL-C2-SR。将重组质粒转入E.coil BL21(DE3)宿主菌中,经IPTG诱导,获得重组表达。重组蛋白带有MBP标签,经Amylose亲合柱和Sephacryl S-200纯化,获得电泳纯的目的蛋白。     

畜禽PPARα基因研究进展

过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是核激素受体家族中的配体激活受体,控制许多细胞内的代谢过程,PPARα作为过氧化物酶体增殖物激活受体家族重要成员之一,是调控机体脂质代谢的重要枢纽,在调控畜禽机体肝脏脂质代谢方面有重要作用。PPARα基因由四个结构域组成,多在机体肝脏和脂肪组织中表达,可作为细胞核受体被外源和内源的特异性配体结合并激活,进而结合靶基因发挥对肝脏脂质代谢的调控作用。就PPARα基因的结构特点及表达模式、PPARα基因对肝脏脂代谢的调控机制,以及现阶段PPARα在畜禽方面的研究进展进行阐述,旨在引起人们对PPARα基因调控脂质代谢的关注,并为畜禽肝脏脂质代谢过程的机理研究和相关疾病的治疗提供一些理论支持。     

人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达

经密码子优化的人工合成草鱼生长激素cDNA与表达载体pET-28a( )重组,构建重组表达质粒PET－GH。转化在肠杆菌BL21（DE3）,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达,12．5％的SDS－PAGE分析显示,大肠杆菌表达产物中含有与草鱼生长激素分子量一致的新增蛋白带,激光密度扫描,其产量约占菌体总蛋白的40％,金属离子螯合层析柱亲和纯化,获得电泳纯的重组蛋白。Western-blotting和酶联免疫吸附受体法检测证实,重组蛋白与抗草鱼生长激素的多克隆抗体发生特异性结合;复性合的重组蛋白有与天然草鱼生长激素一致的生物学活性。     

整合素αMβ2 I-结构域的基因合成和蛋白表达

目的：利用大肠杆菌表达系统表达整合素αMβ2 I-结构域,并对其进行纯化。方法与结果：利用DNAWorks在线引物程序设计经过密码子优化的整合素αMβ2 I-结构域的寡核苷酸序列;采用PCR介导的基因拼装法合成αMβ2 I-结构域DNA模板,将其克隆至原核表达载体pET11d-6h上,并转化大肠杆菌,获得表达菌株;经IPTG诱导,αMβ2 I-结构域在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,表达产物经Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化后,纯度达到90％以上;电喷雾电离质谱测定表明纯化所得的蛋白精确的相对分子质量为23720.0,与预期值相符;肽指纹质谱图谱鉴定其为目的蛋白。结论：αMβ2 I-结构域的高效表达,为进一步研究其与配体的结合及其复合物晶体结构奠定了基础。     

PPARδ启动子克隆及活性分析

过氧化物酶体活化的受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)α、δ、γ是核受体超家族成员,它们是配体调节的转录因子,在脂类代谢过程中起非常重要的作用.PPARδ在骨骼肌中的表达分别要比PPARα和PPARγ高10倍和50倍,它的活化将导致骨骼肌细胞中有氧代谢相关的基因表达升高.为研究PPARδ在骨骼肌中的表达调节,克隆了PPARδ基因5′侧翼区2kb的DNA片段,体外实验证明该片段可以启动GFP表达.然后通过不同的限制酶消化获得不同长度的PPARδ启动子,经启动子活性实验分析发现,转录起始位点5′侧翼区上游179bp的片段就具有启动子活性.通过在线工具对2kb启动子上潜在的转录因子和结合位点进行分析,发现有4个肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor2,MEF2)潜在的结合位点,在MEF2A共转染实验中,发现随着MEF2A浓度升高,2kb的PPARδ启动子转录活性增强,表明MEF2A确实能提高PPARδ启动子活性.上述结果为研究PPARδ在肌肉中的表达调节和功能提供了依据.     

普伐他汀联合罗格列酮上调THP-1巨噬细胞ABCA1表达

目的：观察普伐他汀与罗格列酮联合应用对人巨噬细胞株（THP-1）源性巨噬细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）表达的影响。方法：THP-1细胞经160 nmol/L佛波酯（PMA）孵育24 h,诱导分化成巨噬细胞,分别与普伐他汀及罗格列酮单独或联合作用24 h,提取各组细胞总RNA和蛋白质,分别采用RT-PCR和Western blot检测ABCA1的mRNA和蛋白的表达。结果：普伐他汀增强过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）mRNA表达,但抑制肝X受体（LXR）mRNA表达（P〈0.05）,对ABCA1的表达不产生明显效应（P〉0.05）;罗格列酮单独或与普伐他汀联合作用均可引起ABCA1表达明显增加,同时PPARγ及LXRαmRNA表达亦上调（P〈0.05））。结论：普伐他汀与罗格列酮联合应用能上调巨噬细胞ABCA1的表达。     

PPARα、PPARγ及其双激动剂与动脉粥样硬化

过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs）是核受体超家族中的一类配体依赖的核转录因子,其中两种重要的亚型PPARα和PPARγ在脂肪细胞分化、能量代谢和炎症过程中都发挥重要作用。研究显示,PPARα和PPARγ的配体激动剂不仅可以改善包括糖尿病、高血压和肥胖等在内的胰岛素抵抗综合征,而且还可以通过作用于血管壁从而减缓动脉粥样硬化的进程。本文将就PPARα和PPARγ及其双激动剂与动脉粥样硬化发病机制和治疗的相关研究进展进行概括介绍。     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

PPAR基因在脊椎动物发育过程中的功能研究

过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferstor activated receptor,PPAR)是核激素受体家族中的配体激活受体,在不同的物种中已经发现了它的3种亚型,即PPARα、PPARβ(也有称δ)和PPARγ。通过结合到相应的激活剂上,这些受体在一些重要的代谢途径中刺激靶基因的表达。本文是就PPAR在一些脊椎动物胚胎发育过程中的功能方面作一综述。PPAR的功能表现在脂肪组织、脑组织、胎盘和皮肤的分化方面。     

过氧化物酶体增殖物激活受体α的研究进展

过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator activated receptors,PPARs）作为核受体超家族的一员,其作用广泛,可调节脂肪细胞因子表达、抑制炎症因子、改善胰岛素抵抗等。PPARs有三种亚型,分别是：PPARα、PPARβ／δ和PPARγ。其中PPARα是PPARs最主要的亚型,主要分布在肝脏中。PPARα由不饱和脂肪酸或贝特类降脂药物等配体活化后形成异二聚体,调控靶基因的表达,发挥生物学功能。PPARα参与调节肝脏脂质吸收、脂肪酸氧化、酮体生成、胆固醇代谢等脂代谢过程,以及糖代谢、炎症反应和细胞增殖等,与脂肪性肝病、肝脏炎症反应、乙肝病毒复制和肝癌等肝脏疾病密切相关。本文对PPARα的结构、作用机制、生物学功能及其与肝脏疾病的关系进行综述。PPARα作为肝脏疾病一个新的治疗靶点,阐明其与肝脏疾病发生机制之间的关系,有助于为肝脏疾病的治疗提供新的途径。     

Morganella morganii J-8羰基不对称还原酶的分离纯化及性质研究

由本实验室筛选得到的摩尔摩根氏菌J-8菌株可将底物1-苯基-2-甲氨基丙酮专一性地转化为d-伪麻黄碱。以M. morganii J-8为出发菌株,菌体超声破碎后,经硫酸铵沉淀、Phenyl Superose疏水柱层析、DEAD阴离子柱层析和非变性凝胶电泳四步纯化获得电泳纯羰基不对称还原酶。亚基分子质量为42.5 kD,高效液相色谱分析酶的分子质量约为84.1 kD,初步认为该酶为二聚体蛋白。对所得到的部分纯化酶的酶学性质做了初步研究,纯酶进行基质辅助激光解析电离-飞行质谱分析,比对结果显示为与亮氨酸脱氢酶蛋白有很高相似性。     

以纤连蛋白(FN)细胞结合片段研究大鼠肝星状细胞FN受体表达及调控

应用亲和层析、凝胶过滤法以及X型蛋白酶消化结合制备电泳分别提取纯化大鼠FN及FN细胞结合片段（120 KDa FN-f）,后经生物素标记后,用亲和细胞化学方法研究大鼠肝星状细胞（HSC）FN受体（FNR）表达及调控。结果显示,生物素标记的120KDa FN－f与FNR的结合具有特异性。原代培养5d、7d的正常大鼠HSC表达FNR较培养1d、3d的明显增强,血小板源性生长因子（PDGF）和转化生长因子－β、（TGF－β1）可上调大鼠HSC表达FNR,全反式维甲酸（atRA）则下调细胞因子再激活的HSC表达FNR,并呈剂量依赖性。本建立了检测FNR的一种新方法,即配体（120KDa FN-f）－受体（FNR）亲和细胞化学方法,该方法能反映FNR的总体水平及活性状态。同时初步探讨了影响大鼠HSC表达FNR的因素,确切机制有待进一步研究。     

重组猪源胰蛋白酶原的构建、表达与活性分析

目的：构建、表达重组猪源胰蛋白酶原,并对其进行分离纯化和酶活性分析。方法：利用大肠埃希菌表达系统（pET-28a,宿主菌BL21 DE3）优化天然猪源胰蛋白酶原基因,经乳糖诱导表达重组胰蛋白酶原蛋白,采用阴离子交换色谱法分离纯化,以SDS-PAGE 电泳鉴定目标蛋白,以紫外分光光度法检测重组蛋白的酶活力。结果：测序结果表明,重组猪源胰蛋白酶原基因工程菌构建成功,SDS-PAGE检测显示目的蛋白条带位置与标准猪源胰蛋白酶条带位置一致,且酶活力可达513.09 U?mg-1。结论：成功获得了重组猪源胰蛋白酶原,且酶活力较好,为进一步研究生产提供了基础。     

人源TNFα的原核表达及活性测定

目的:利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法:利用PCR技术,从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列,并在其上游添加SUMO标签,与原核表达载体pET28a连接,构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21(DE3)工程菌中表达融合蛋白,经Ni-NTA纯化体系纯化,切除SUMO标签,纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性,以测定TNFα的生物学活性。结果:成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21(DE3)工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8μg/ml。结论:成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα,经表达、纯化、酶切及再纯化,获得有生物活性的hTNFα蛋白,为深入研究和利用hTNFα奠定基础。     

黑素皮质素受体-2基因表达调控相关因子研究进展

黑素皮质素受体-2（melanoeortin2-receptor,MC2R）属于A类七个跨膜α螺旋G蛋白受体,具有通过CA／cAMP／PKA信号转导途径调节类固醇激素分泌的昼夜节律和应激引起变化的功能。MC2R基因表达障碍可导致一种常染色体隐性遗传疾病,即家族性糖皮质激素缺陷（FGD）。黑素皮质素受体-2（melanocortin2-receptor,MC2R）基因在特定组织中是否表达,表达丰度的高低是由多种调控因子相互作用决定的。本文就参与其表达调控的类固醇转录因子-1（steroidogenic factor-1,SF-1）、过氧化物增值物激活受体γ（PPARγ）、视黄酸X受体α（RXRα）、活化激活蛋白1（activatorproteinl,AP-1）DAX-1（dosage-sensitive sexreversal adrenal hypoplasia gene on the X chromosome,gene-1）和E-盒结合蛋白等因子做一综述。     

VEGF受体KDR结合区的克隆与表达

KDR是血管内皮生长因子(VEGF)的主要受体之一,它在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用.为了获得人重组的有VEGF结合活性的KDR,通过RT-PCR从人胎儿脐静脉内皮细胞（EC）扩增出编码KDR胞外Ⅰ～Ⅳ区片段,将其克隆在谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白表达载体pGEX2T中,并在大肠杆菌中获得稳定表达.表达的融合蛋白GST-KDR以包涵体形式存在,其分子质量约66 ku左右.经碱变性法大量提取,及制备胶电泳获得纯化的KDR,为进一步的研究奠定了基础.