鱼腥藻Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

随着更多蓝藻全基因组序列测定完成,蓝藻基因工程研究现已进入后基因组时代。2001年Kaneko等完成了鱼腥藻7120全基因组序列测定,随后人们利用生物信息学的方法对其中一些基因的功能进行了预测,包括Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）基因,但该基因是否编码Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶及该产物的相关酶学特性至今尚未见报道。通过PCR克隆到鱼腥藻7120中预测的Ⅱ型FBA基因,插入到质粒pET-32a的相应位点,构建成原核表达载体pET-FBA-Ⅱ。蛋白电泳结果显示,重组蛋白的表达量占总蛋白含量的23．4％,与蛋白分子标记相比,其分子量约为40kDa。酶学活性测定结果表明,其蛋白粗提物的比活力为11．8U（mgprotein）^-1,具有标准Ⅱ型FBA活性。证实了Cyanobase中关于该基因功能的预测,也为进一步研究该基因表达产物的生理生化特性及功能提供了重要资料。     

胡杨果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因PeALD的克隆及耐盐性分析

胡杨(Populus euphratica Oliv)是优良的抗逆树种,有很强的耐盐碱性.前期胡杨转录组研究结果显示盐胁迫可诱导果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因(PeALD)转录上调,提示该基因可能对胡杨耐盐性方面有某种贡献.为分析PeALD基因在胡杨耐盐性中的作用,本研究以胡杨为材料,利用RT-PCR方法克隆了胡杨果糖-1,6-二磷酸醛羧酶基因的全长cDNA,通过基因转化法尝试在烟草中过量表达该基因,并对转基因株系的耐盐性进行初步分析.研究结果显示,克隆的cDNA编码果糖-1,6-二磷酸醛羧酶,ORF为1 177 bp,是由247个氨基酸编码的疏水性蛋白,理论等电点为6.84,分子量为26.79 kD.PCR与RT-PCR检测结果表明,外源的PeALD基因通过转化已经整合到烟草的染色体中,并在4个株系中得到较强的表达.转化株系表型筛选实验表明,在200 mmol/L NaCl的MS培养基中培养15 d后,野生型烟草植株无明显高生长,叶片全部黄化并萎缩;而转基因烟草高生长基本没有受到抑制,植株生长良好.说明在烟草中过表达PeALD使转化植株的耐盐性显著提高.光合数据结果显示,ALD基因能够降低盐胁迫对烟草叶片净光合速率的影响,可能是PeALD过表达加速了卡尔文循环的运转,提高了CO2的固定速率,进而促进了光合活性,通过光合作用促进碳的积累,利于呼吸作用和氧化磷酸化产生ATP,为维持跨膜质子浓度梯度提供能量,从而有可能促进质膜上的Na+/H+逆向转运,利于细胞质膜保持拒盐性.这些结果初步验证了PeALD基因的耐盐性功能,为进一步深入研究该基因在耐盐机制中的作用奠定了良好基础.     

丝状真菌转化葡萄糖为果糖-1,6-二磷酸的研究

STUDYONTHEBIOCONVERSIONOFGLUCOSETOFRUCTOSE-1,6-DIPHOSPHATEWITHFILAMENTOUSFUNGICELLMOXiao-Yan;ZHANGu-Yu;XIANGYuHong(DepartmentofBiotechnology,XianJiaotongUniversity,Xian7l0049)80至90年代发现果糖一l,6一二磷酸（Fructose－l,6－diphosphateFDP）在医药、保健品和植物生长调节方面的诸多用途,尤其用于医药备受关注。传统FDP的生产是用面包酵母或啤酒酵母作酶源,通过糖酵解过程而获得（Leisolaetal,1974）,以后有用固定化酵母细胞、固相化多酶系统及嗜热脂肪芽胞杆菌转化葡…     

受NaCl诱导的盐藻果糖-1,6-二磷酸醛缩酶cDNA的克隆及其在烟草中的表达

采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术, 获得了盐藻(Dunaliella salina)受诱导表达的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶全长cDNA (DsALDP). 蛋白质序列分析发现, DsALDP与许多植物叶绿体的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(AldP)具有较高的同源性(66%~73%). 系统进化分析进一步证明DsALDP与藻类的AldP亲缘关系最近. 就表达谱而言, DsALDP是NaCl诱导下新表达的转录本, 其表达水平随诱导时间的不同而呈显著变化. 筛选的DsALDP cDNA构建到双元载体pBI121并导入农杆菌用以转化烟草, 对4个T₁代转基因植株进行Southern检测, 证明DsALDP已整合入转基因植株的基因组. RT-PCR分析显示DsALDP在这些植株中均得到有效表达. 生物测试表明, T₁-1, T₁-2和T₁-3植株在100~200 mmol/L NaCl下仍保持醛缩酶活性, 且其脯氨酸含量均有不同程度的升高.     

1,6-二磷酸果糖与细胞保护

1,6-二磷酸果糖是细胞内糖代谢的中间产物,是能在分子水平上调节细胞代谢中若干酶活性,作为恢复和改善细胞代谢的药物,可通过多方面因素减轻细胞损伤,从而对细胞起保护作用。     

刚地弓形虫RH株果糖1，6-二磷酸醛缩酶的基因序列分析与融合表达

目的：对编码刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因进行克隆和序列分析,并构建原核栽体pETcFN融合表达该重组蛋白,以研究该分子在弓形虫速殖子入侵中的作用。方法：从刚地弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增编码果糖1,6-二磷酸醛缩酶的基因,并克隆到T载体上,测序确认;通过PCGENE及在线工具对此编码序列进行分析;将该基因亚克隆到表达栽体pET30a（＋）上,构建质粒pETcFN;表达产物用Western blot进行进一步确认。结果：经PCR鉴定和质粒双酶切鉴定后测序,确认插入T栽体的序列为所需的目的序列。根据序列分析,推断蛋白的预计分子量为39．2kDa,等电点为7．75;BLAST分析,发现同源性52％以上的序列32条;模序分析发现其分别在223～233、21～147及15～363位置隐含有与PS00158（PmfileScan）、PD001128（BlastProDom）及PF00274（HMMPfam）相似的模序,这些序列分子功能均为果糖二磷酸醛缩酶活性。该编码片段亚克隆到栽体上成功构建融合表达质粒pETcFN,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,得到分子量为43kDa的融合蛋白。Western blot的结果与预测相符。     

固定化酵母细胞生产1,6-二磷酸果糖研究

本文研究了固定化酵母细胞制备果糖1,6二磷酸(FDP)的方法及其生产。用卡拉胶包埋方法固定化酿酒酵母(Sacchromyces cerevisae),对含葡萄糖1.0M,磷酸盐0.8M的糖磷液,pH6.5,在37℃下进行磷酸化反应。反复分批转化20天以上,可达到平均产FDPH_427.58mg/ml,最高为59.94mg/ml。用100ml固定化细胞生物反应器连续运转309h,稀释速率D=0.097h~(-1),平均产FDPH_4 21.51mg/ml。20L反应器连续运转,生产能力达到1.7g/h.L。用层析方法制备FDPNa_3结晶粉,提取收率为72.08％,制备质量达到或超过了国内外同类产品的质量要求。     

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶共表达对蓝藻光合作用效率的影响

以转高等植物ALD和TPI基因的鱼腥藻 7120为对象 ,研究了ALD和TPI两个酶表达量对细胞光合固碳效率的影响。考察了初始pH、NaHCO₃浓度和CO₂浓度对转基因藻和野生藻生长、光合活性及无机碳亲和力的影响。结果表明 ,转基因藻在较高碳源浓度下 ,其生长速率和光合放氧活性比野生藻有显著的提高 ,并且可以比野生藻耐受更高的pH。在含有2%CO₂的空气中 ,转基因藻对外源无机碳的亲和力比野生藻提高了4.06倍.     

水稻胞质FBA基因在鱼腥藻7120中的表达及其对光合作用的调控

光合作用包括了一系列复杂的反应,其中碳固定反应是光合作用调控的核心环节。果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)是Calvin循环中固定CO₂后第一个催化三碳化合物转变为六碳化合物的酶,在光合作用中有着重要的作用。近年来,反义技术进一步地证明了FBA在加速碳固定反应方面有着非常大的潜力。本论文通过过表达技术来研究提高FBA活性是否能加速碳固定反应。将水稻胞质FBA嵌合基因转入鱼腥藻7120,通过相应的抗生素筛选及PCR鉴定后,确定得到了稳定遗传的转基因藻。对转基因藻和野生藻进行FBA活性及生理活性的测定后发现：转基因藻中FBA的活性比野生藻提高了31.2%;细胞生长速率比野生藻提高了24.4%;净光合与真实光合分别比野生藻提高了19.2% 和20.6%。以上结果证明,在鱼腥藻体内特异的提高非调控酶FBA的水平,能在一定程度上提高转基因藻的光合活性,并且能够提高转基因藻的细胞增长效率。为进一步研究FBA在光合碳流量中的调控机理提供实验依据。     

银鲫果糖-1,6-二磷酸酶的分子克隆与表达分析

果糖-1,6-二磷酸酶(EC 3.1.3.11)是糖异生中的关键限速酶之一, 在糖代谢中起重要作用。哺乳动物存在肝脏型和肌肉型两种果糖-1,6-二磷酸酶同工酶,分别由Fbp1和Fbp2编码。银鲫作为我国重要的经济养殖鱼类, 尚无果糖-1,6-二磷酸酶基因的有关资料, 其组织分布特征和胚胎发育模式亦不清楚。本研究采用RACE方法从银鲫原肠胚SMART cDNA文库中扩增了果糖-1,6-二磷酸酶基因的全长cDNA, 其长度为1170 bp,编码337个氨基酸残基,多重序列比对和系统发育分析表明该基因为肝脏型果糖-1,6-二磷酶。RT-PCR分析虽在银鲫的肝、脑、心、脾、肾、肠、肌肉和卵巢组织中皆能检测到该基因的表达, 但以肝组织的表达量最高。Western Blot检测表明, 肝脏组织除有一条与其他组织(肌肉除外)共有的蛋白带之外,还有一条特异带;肌肉中有不同于其他组织的特异带。成熟卵子和不同发育阶段胚胎的RT-PCR和Western Blot分析都可检测到母源的CagFbp转录本和蛋白,且其转录本从原肠期开始上升, 到神经胚时迅速上升到较高水平, 其蛋白从尾芽期以后出现一条比母源蛋白分子量小、与肝脏的特异带大小基本相同的蛋白带。这些结果证实本研究克隆的CagFbp为肝脏型,且鱼类至少存在肝脏型和肌肉型两种果糖-1,6-二磷酸酶同工酶。       

Characterization of a Mn-dependent Fructose-1,6-bisphosphate Aldolase in Deinococcus radiodurans

The key enzyme of the glycolytic pathway of Deinococcus radiodurans, fructose-1,6-bisphosphate aldolase, could be induced independently by glucose and Mn. The enzyme exhibited the characteristics of the metal-dependent Class II aldolases. Unlike most Class II aldolases, the deinococcal aldolase preferred Mn, not Zn, as a cofactor. The fbaA gene encoding the deinococcal aldolase was cloned and the protein overproduced in various Escherichia coli expression hosts. However, the overexpressed deinococcal enzyme aggregated and formed inclusion bodies. Dissolving these inclusion bodies by urea and subsequent purification by nickel affinity chromatography, resulted in a protein fraction that exhibited aldolase activity only in the presence of Mn. This active aldolase fraction exhibited masses of about 70 kDa and 35 kDa by gel filtration and by SDS gel electrophoresis, respectively, suggesting that the active aldolase was a dimer.     

丙糖磷酸异构酶、果糖—1，6—二磷酸醛缩酶及果糖—1，6—二磷酸酶的共表达

致力于建立一条控制或降低大气中CO2浓度的途径,选择对 进行代谢工程以便改进其光合固定CO2的效率。作为研究的初始阶段,将编码丙糖磷酸异构酶、果糖－1,6－二磷酸醛缩酶及果糖－1,6－二磷酸酶的3个基因构建进一个由启动子trc控制的表达质粒pTrcFAT,成功地在大肠杆菌中实现了上述3个基因的活性共表达。活性测定结果显示：从1L培养液获得的破菌上清液每分钟可以催化二羟丙酮磷酸（DHAP）转化成700μmol果糖－6－磷酸。在此基础上进一步构建了这3个基因共表达的大肠杆菌－蓝藻穿梭表达质粒,也在大肠杆菌中实现了活性表达,当外泊基因的操纵子与载体质粒以大于1：1的比例进行构建时,可显著提高外源基因的表达量及相应的的酶活性。     

Structure-based Reevaluation of the Mechanism of Class I Fructose-1,6-bisphosphate Aldolase

The enzymatic reaction carried out by class I fructose-1,6-bisphosphate aldolase is known in great detail in terms of reaction intermediates, but the precise role of individual amino acids in the active site is poorly understood. Therefore, on the basis of the crystallographic structure of the complex between aldolase and dihydroxyacetone phosphate a molecular modelling study was undertaken to predict the Michaelis complex with fructose-1,6-bisphosphate and several covalent enzymatic reaction intermediates. This model reveals the unknown 6-phosphate binding site and assigns distinct roles to crucial residues. Asp33 is responsible for aligning the 2-keto function of the substrate correctly for nucleophilic attack by Lys229, and plays a role in carbinolamine formation. Lys146 assists in carbinolamine dehydration and is essential for stabilising the developing negative charge on O4 of fructose-1,6-bisphosphate during hydroxyl proton abstraction by Glu187. Subsequently, Glu187 is also responsible for protonating C1 of the dihydroxyacetone phosphate enamine. In addition, the absolute configuration of the fructose-1,6-bisphosphate carbinol intermediate is shown to be (2S), in agreement with the crystal structure, but opposite from the interpretation in the literature of the stereospecific reduction of the aldolase fructose-1,6-bisphosphate complex with sodium borohydride. It is demonstrated that the outcome of the latter type of experiment critically depends on conformational changes triggered by Schiff base formation. Electronic Supplementary Material available.     

Fructose-1,6-bisphosphate,a regulator of metabolism

Summary Fructose-1, 6-bisphosphate affects the rate of a large variety of enzyme reactions. In some instances its role as a physiologic effector is well documented. In many cases the effects of fructose bishosphate on particular enzymes have been demonstrated in vitro but the link to physiologic conditions has not yet been established. It is the purpose of this paper to summarize the scattered findings in fructose bisphosphate as an effector of enzyme reactions and to draw some conclusions about the role of the compound in metabolic regulation.     

Location of the Structural Gene for Fructose-1,6-Diphosphate Aldolase in Escherichia coli

Gene fda has been mapped, by co-transduction, between thyA and serA on the Escherichia coli chromosome.     

鱼腥藻II型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

随着更多蓝藻全基因组序列测定完成,蓝藻基因工程研究现已进入后基因组时代。2001年Kaneko等人完成了鱼腥藻7120全基因组序列测定,随后人们利用生物信息学的方法对其中一些基因的功能进行了预测,包括II型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)基因,但该基因是否编码II型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶及该产物的相关酶学特性至今尚未见报道。本文通过PCR克隆到鱼腥藻7120中预测的II型FBA基因,插入到质粒pET-32a的相应位点,构建成原核表达载体pET-FBA-II。蛋白电泳结果显示,重组蛋白的表达量占总蛋白含量的23.4%,与蛋白分子标记相比,其分子量约为40 kDa。酶学活性测定结果表明,其蛋白粗提物的比活力为11.8 U (mg protein)-1,具有标准II型FBA活性。本研究不仅证实了Cyanobase中关于该基因功能的预测,也为进一步研究该基因表达产物的生理生化特性及功能提供了重要条件。     

孔石莼(Ulva pertusa)质体蓝素基因的克隆及基因特征分析(英文)

采用cDNA末端快速扩增的办法,从孔石莼(Ulva pertusa)中克隆获得质体蓝素基因。该基因完整的cDNA为787bp,包括40 bp 5’端非编码区和327 bp的3’端非编码区,以及一个420 bp的开放阅读框架,编码139个氨基酸的蛋白质。该基因编码质体蓝素的前体肽,其N端41个氨基酸残基为信号肽,后面为98个氨基酸残基的成熟肽。从Genbank中选择了13个质体蓝素的前体肽基因进行序列比对分析和构建进化树。孔石莼质体蓝素基因与其它质体蓝素基因的同源性为48.2%至78.8%。该进化树将来源于6种藻类植物的7个质体蓝素基因聚类在一起,显示出它们较近的进化关系。同样,也表现出11种生物的分子进化关系。序列比对结果显示,在质体蓝素的基因序列中存在两个高度保守的基序,它编码质体蓝素蛋白的铜结合活性位点。