发酵液中多拉菌素的提取和萃取条件研究

采用单因素实验,分别研究提取试剂、发酵液放置时间、pH值和温度对发酵液中多拉菌素提取效果的影响;然后以乙酸乙酯为萃取试剂,研究萃取次数及萃取体积对多拉菌素萃取效果的影响。结果显示,甲醇为最佳提取试剂;发酵液在pH为3～11、温度为20～80℃的条件下放置144 h,多拉菌素均能稳定存在,提取得到的多拉菌素的质量浓度没有显著变化;浓缩提取液液经2倍体积乙酸乙酯萃取2次即可。该条件下多拉菌素的质量浓度和萃取率分别为151.78μg/mL和98.00%。     

多拉菌素产生菌aveD基因缺失突变株的构建

阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)bkd76-3在发酵过程中添加环己羧酸(CHC)可产生抗寄生虫药物多拉菌素(doramectin,阿维菌素衍生物CHC-B1),但同时还产生其它三种无效组分CHC-B2、CHC-A1、CHC-A2。利用基因缺失载体pXJ04(pKC1139∷△aveD1+△aveD2)对该菌株的aveD基因进行缺失,获得的aveD缺失突变株经摇瓶发酵和HPLC检测,发现只存在2种产物,经LC/MS分析验证,这两种产物分别为CHC-B1和CHC-B2,表明该突变株完全丧失了合成CHC-A1和CHC-A2的能力。缺失突变株的CHC-B1产量较出发菌株提高了78.19%,CHC-B2的产量提高了602.3%,发酵产物中有效组分多拉菌素的比例增加了93.16%。该缺失突变是在染色体上通过同源双交换完成的,不会发生进一步的重组,因此突变株具有良好的遗传稳定性,在工业生产上具有应用价值。     

杀念菌素/FR-008生物合成途径中转运基因fscTI与fscTII的功能

摘要:【目的】分析杀念菌素/FR-008 生物合成途径中转运基因fscTI和fscTII的功能。【方法】构建转运基因fscTI和fscTII的敲除质粒pJTU4137,并通过接合转移和同源重组双交换的方法得到转运基因缺失突变株。转运基因fscTI和fscTII也被克隆到高拷贝质粒pJTU1278上用于在链霉菌FR-008(Streptomyces sp．FR-008)的衍生菌株ZYJ-6中进行转运蛋白的过量表达。【结果】获得了转运蛋白缺失的双交换突变株LX10,发酵结果显示该突变株不再产生杀念菌素及其衍生物;过量表达转运蛋白的基因工程菌株LX11,其杀念菌素的产量约是对照菌株的1.5倍。【结论】体内遗传实验进一步证实FR-008生物合成途径中的fscTI和fscTII是ATP依赖的ABC转运基因,fscTI与fscTII的过量表达增加了杀念菌素的产量,为利用此方法提高其它多烯类抗生素的产量提供了例证。     

杀念菌素/FR-008生物合成途径中转运基因fscTⅠ与fscTⅡ的功能

[目的]分析杀念菌素/FR-008生物合成途径中转运基因fscTⅠ和ficTⅡ的功能.[方法]构建转运基因fscTⅠ和fscTⅡ的敲除质粒pJTU4137,并通过接合转移和同源重组双交换的方法得到转运基因缺失突变株.转运基因fscTⅠ和ficTⅡ也被克隆到高拷贝质粒pJTU 1278上用于在链霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)的衍生菌株ZYJ-6中进行转运蛋白的过量表达.[结果]获得了转运蛋白缺失的双交换突变株LX10,发酵结果显示该突变株不再产生杀念菌素及其衍生物 ;过量表达转运蛋白的基因工程菌株LX11,其杀念菌素的产量约是对照菌株的1.5倍.[结论]体内遗传实验进一步证实FR-008生物合成途径中的fscTⅠ和fscTⅡ是ATP依赖的ABC转运基因,fscTⅠ与fscTⅡ的过量表达增加了杀念菌素的产量,为利用此方法提高其它多烯类抗生素的产量提供了例证.     

竹黄菌发酵生产竹红菌素的研究进展

竹黄作为名贵中药,其主要成分竹红菌素是优良的天然光敏药物。由于天然竹黄资源有限,通过竹黄无性型菌株发酵生产竹红菌素因而受到广泛关注。通过介绍竹黄无性型菌株的固态、液态发酵,分析了竹红菌素发酵生产的各种影响因子,并对竹红菌素合成诱导物质及高产菌株诱变筛选等进行了综述,为竹红菌素合成调控和发酵生产提供了参考。     

蛹虫草表型多态性对子实体产生及虫草菌素的影响

为选育高产子实体和虫草菌素的蛹虫草菌株,从野生蛹虫草中分离单孢子并进行分型,之后进行产子实体实验;同时对蛹虫草子实体进行了产孢结构的观察,并用高效液相色谱仪检测了子实体和培养基中的虫草菌素。结果表明,菌落背面颜色为橙铬色的菌株容易产生子实体;出发(原代)菌株所产子实体在形态上更接近野生蛹虫草,而角变株的子实体畸形;出发菌株产子实体能力要比该菌株未发生角变部分分离株和角变部分分离株都强。在虫草菌素的产量上也以出发菌株为高,表明表型多态性对蛹虫草产子实体和虫草菌素有很大的影响。这对于优势菌种的筛选和生产实践有借鉴意义。     

里氏木霉306菌株筛选及其产酶特性的研究

里氏木霉(Trichoderma reesei)306是染色体上整合有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA的基因工程菌株。本论文利用筛选平板筛选出产t-PA活力高和产蛋白酶活力高的两种基因工程里氏木霉306菌株,然后对它们发酵过程中的产酶特性进行研究。结果表明:菌株产蛋白酶活力的大小与生物合成t-PA活力大小之间有一定的关系,产蛋白酶活力相对高的菌株产t-PA的活力相对低,而产蛋白酶活力相对低的菌株,产t-PA活力相对就高。     

滑桃树种子提取物对其内生菌活性化合物的影响北大核心CSCD

Streptomyces sp.WXC菌株是从滑桃树(Trewia nudiflora)种子中分离到的一株内生菌,滑桃树种子提取物对Streptomyces sp.WXC菌株的生长和活性化合物的表达有促进作用。运用HPLC、RT-PCR和Real-time PCR技术,研究Streptomyces sp.WXC菌株在加入滑桃树种子提取物和不加入滑桃树种子提取物的两种条件下,其活性化合物富伦菌素B产量及其生物合成基因表达量的差异。结果显示,滑桃树种子提取物诱导了活性化合物富伦菌素B生物合成基因的表达,从而提高了富伦菌素B的产量。首次揭示了植物与其内生放线菌之间的化学作用。     

一株产冠菌素新菌种的分离与鉴定

【目的】从不同样本中分离筛选性能稳定的产冠菌素菌株。【方法】根据冠菌素引起植物叶片产生弥散性黄萎病、块茎膨大的特性,采集各种植物病叶、病枝及感病植物的土壤,采用穿刺法与系列稀释法分离筛选菌株;液相色谱测定菌株产生的冠菌素;在电子和光学显微镜下观察菌体形态;根据生理生化试验、(G+C)mol%含量、16S rDNA序列分析等对菌株进行鉴定;对分离提纯的发酵产物进行紫外、质谱和红外分析。【结果】菌株BBC933为革兰氏阴性菌,端生鞭毛,短杆状,无芽孢。在41℃下不生长,细胞内有聚β-羟基丁酸盐颗粒积累,没有精氨酸双水解酶和氧化酶,不能水解淀粉、明胶,不进行硝酸还原及反硝化作用,过氧化氢酶反应呈阳性。菌株的(G+C)mol%含量为67.2%,根据该菌株16S rDNA序列的同源性分析,构建系统发育树。【结论】菌株BCC933鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholder cepacia),具有产冠菌素性能。国内外未曾见报道洋葱伯克霍尔德氏菌产冠菌素。     

活性污泥性质对基因工程菌吸附影响研究

基因工程菌主要是利用DNA重组技术所得,在DNA重组技术导向下可以达到选育优良菌株的目的并可按照意向对基因进行点缀从而得到特定的药物类菌株即为基因工程菌。基因工程菌可得到特异化产品以并让产品的生产水平得到大幅度提升,正是基于上述特点使其近年来受到愈来愈广泛的关注。在废水强化处理过程中对于基因工程菌而言活性污泥性质对其生存具有密切的关联性。相关研究证实基因工程菌吸附于污泥絮体后可让基因工程菌的生存能力得到大幅度提升。基于上述观点本文分析了活性污泥性质对基因工程菌吸附影响,供以参考。     

太空搭载泰乐菌素高产菌株的选育

研究了弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)9904S -86经过空间搭载(第十八颗返回式科学与技术试验卫星),经受太空中的特殊复杂条件(高真空、微重力、强辐射、交变磁场等)诱发菌株发生诱变,并且进行分离筛选,最终选育出一株高产泰乐菌素菌株T1-156-84-23-s67,该菌株摇瓶效价达到15266u/mL,比出发菌株9904S -86(8742u/mL)提高74.6%。并对高产菌株的菌落形态特征、培养特征等方面进行了研究,通过菌株的全细胞蛋白SDS—聚丙烯酰胺凝胶分析,发现搭载菌株与出发菌株的全细胞蛋白指纹图谱也有显著差异。结合菌株传代稳定性试验,说明该菌株已发生了遗传性变异,是经太空诱变后所选育的泰乐菌素高产菌株。     

绿僵菌素对爪哇棒孢霉SP053菌株的影响及其混用对小菜蛾的联合毒力

为了寻找更有效的利用虫生真菌爪哇棒孢霉Isaria javanicus防治小菜蛾Plutella xylostella的新方法, 测定了绿僵菌素（destruxin）对SP053菌株生长发育与产孢量与萌发率的影响, 利用协同毒力指数法和毒力回归分析法评价了两者混用对小菜蛾2龄幼虫的联合毒力。结果表明: 绿僵菌素对SP053菌株菌丝生长、孢子萌发率和孢子产量均无显著影响（P>0.05）。而一定浓度的绿僵菌素与SP053菌株分生孢子混用具有增效作用, S50-CD100（指爪哇棒孢霉SP053菌株的分生孢子浓度为50×10⁵个/mL和绿僵菌素粗毒素的浓度为100 mg/L的组合; 依此类推）、S25-CD100、S25-CD50及S12.5-CD100等混配组合都有显著的增效效果, 尤其以S25-CD100组合增效效果最好, 其48 h和72 h的协同毒力指数（c.f.）分别达到52.31和31.07。毒力回归分析结果也显示, 添加绿僵菌素粗毒素25~100 mg/L的混剂的LC50值明显降低, 比如添加100 mg/L绿僵菌素粗毒素的混剂（SP053-CD100）, 其48和72 h的LC50分别为17.45和10.55 （×10⁵个孢子/mL）, 而SP053菌株分生孢子单剂的LC50相应值为>50和35.85（×10⁵个孢子/mL）。本研究证明绿僵菌素与爪哇棒孢霉SP053菌株混用有增效作用, 对改进小菜蛾的生物防治方法有一定指导意义。     

一株泰乐菌素高效降解菌的分离鉴定及其降解特性

【目的】从长期堆放泰乐菌素药渣附近的土壤中分离出泰乐菌素降解菌,并考察其对泰乐菌素的降解特性。【方法】采用梯度驯化、划线分离法筛选出泰乐菌素优势降解菌,通过形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析方法对其进行系统发育分析及菌种鉴定,并考察菌株对泰乐菌素的降解特性。【结果】从长期堆放泰乐菌素药渣的土壤中分离得到1株泰乐菌素高效降解菌,命名为TS1,其为革兰氏阴性杆菌,菌落形态呈圆形,乳白色,表面光滑,不透明,边缘整齐,鉴定为越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)。该菌株在温度35°C、pH 7.0的条件下培养72 h,对初始浓度为300 mg/L泰乐菌素的降解率可达99%以上。【结论】说明菌株TS1对泰乐菌素具有良好的降解特性,可用于生物修复被泰乐菌素废渣废水污染的生态环境。     

fcl基因对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及生长发育的影响

fcl基因编码的GDP-岩藻糖合成酶(GDP fucose synthetase,GFS),能催化由GDP-D-甘露糖合成GDP-L-岩藻糖过程中的两步差向异构酶和还原酶反应;还参与氨基糖和核糖的生物合成,是调控生物体糖代谢、核苷酸代谢的关键酶之一。通过前期基因组测序表明须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona中存在fcl基因。利用基因工程技术构建了fcl基因的过表达菌株S. pogona-fcl和敲除菌株S. pogona-Δfcl。结果表明该基因对菌株生长发育、蛋白表达及其转录水平、杀虫活性、丁烯基多杀菌素的生物合成均存在影响。经HPLC分析显示,S. pogona-Δfcl的丁烯基多杀菌素产量增加为野生型菌株的130%,S.pogona-fcl的丁烯基多杀菌素产量降低了25%。生测结果显示,与野生型菌株相比S.pogona-Δfcl对棉铃虫的杀虫活性明显增强,而S.pogona-fcl的杀虫活性降低。利用扫描电镜观察发现,S. pogona-Δfcl菌丝体表面出现褶皱,呈现短棒状,S. pogona-fcl菌丝形态与野生型菌株一致。以上结果表明,fcl基因的敲除影响菌丝体的生长发育,能促进丁烯基多杀菌素的生物合成和增强杀虫活性,该基因的过表达抑制了丁烯基多杀菌素的生物合成和降低了杀虫活性。SDS-PAGE结果表明,三株菌株在96 h时蛋白表达差异最为明显。对差异蛋白通过实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,三菌株蛋白的转录水平存在显著表达差异。通过研究结果构建了网络代谢调控图,分析fcl基因对须糖多孢菌生长发育及丁烯基多杀菌素生物合成代谢调控网络途径的影响,初步构建了fcl基因调控的代谢途径,为揭示丁烯基多杀菌素生物合成的调控机制及相关后续研究提供了实验依据。     

真菌发酵生产γ-亚麻酸的研究进展

综述了国内外微生物发酵生产γ-亚麻酸（GLA）的研究进展,对菌株诱变选育研究和基因工程菌株的构建情况进行了阐述,并展望了其发展前景。     

Shiraia sp.SUPER-H168液态发酵产竹红菌素过程中生理特征初步研究

通过对竹黄菌株SUPER-H168产竹红菌素及不产竹红菌素时生理特征的研究,发现MDA、胞内及胞外的总抗氧化力、过氧化氢、维生素C的含量均比对照组高;CAT的活力上升,而SOD活力总体稍有下降。实验结果表明,菌体产竹红菌素初期伴随着其自身氧化水平的上升。添加终浓度为40μmol/L的过氧化氢可以促进竹红菌素生成。     

瑞拉菌素产生菌S-5120菌株防治黄瓜霜霉病害的研究初报

经黄瓜霜霉病孢子萌发试验和离体叶片抑菌试验表明,瑞拉菌素产生菌S-5120菌株和瑞拉菌素均对黄瓜霜霉病有较强抑制作用。温室防病试验表明,瑞拉菌素产生菌S-5120发酵液对黄瓜霜霉病有明显的保护和治疗作用。相对保护效果达75．17％;治疗效果达69．69％,且高于农抗-120的相对防效62．65％。     

安徽省三种产地竹黄菌培养的初步研究

首次对安徽省三种产地的竹黄菌进行了组织分离培养和液体发酵,比较了该菌固体生长状况和液体发酵形成的竹红菌素产量。结果显示,广德卢村的菌种平皿生长速度为0．31cm／d,液体发酵产生的竹红菌素吸光度为0．21;宁国板桥菌种平皿生长速度为0．30cm／d,液体发酵产生的竹红菌素吸光度为0．30;休宁武城的竹黄菌平皿生长速度为1．85cm／d,菌株液体发酵产生的竹红菌素吸光度为O．39。结论表明,休宁武城菌种无论是平皿生长速度还是发酵形成的竹红菌素量都明显优于其它两地的菌株。     

竹黄菌液体培养下产竹红菌素的研究

先对不同产地采集的竹黄菌进行筛选,得到优产竹红菌素的菌株,然后采用单因子和3因素3水平正交试验法对竹红菌素液体发酵条件进行优化,在优化培养基的基础上,选用不同浓度的Cr3+、Fe3+、Cu2+和Ca2+对竹红菌素进行离子调控研究。结果表明:从休宁所采集的菌株不仅生长速度最快,发酵所产的竹红菌素含量也最高;竹红菌素最佳发酵碳源是葡萄糖,最佳发酵氮源是硝酸钠,最佳培养基组合为2%葡萄糖,0.2%硝酸钠,pH7.5;Cr3+和Fe3+浓度为0.005%时竹红菌素含量均最高;0.05%的Ca2+最有利于竹红菌素的分泌;Cu2+为0.03%时竹红菌素含量达到最大值。     

适应性进化与甜菜碱的添加促进安丝菌素的生产

【背景】安丝菌素是一类由珍贵束丝放线菌橙色亚种(Actinosynnema pretiosum ssp. auranticu)生产的美登素类衍生抗生素,属于大环内酰胺类物质,根据不同的C-3位基团可以分为一系列衍生物。目前已上市的高效抗癌药物曲妥珠单抗(T-DM1)以AP-3 (Ansamitocin P-3)为生产底物,并表现出很好的乳腺癌治疗效果。然而当前AP-3的产量较低,其过高的成本限制了进一步发展。【目的】应用适应性进化及添加适量甜菜碱策略提高安丝菌素AP-3的产量。【方法】以珍贵束丝放线菌橙色亚种为出发菌株,链霉素和巴龙霉素为胁迫压力进行适应性进化,筛选出安丝菌素积累较高的菌株,随后向进化菌株的发酵培养基中添加0.1%的甜菜碱,AP-3的产量进一步提高,同时分析了进化菌株AP-3相关基因的转录水平,初步探索进化菌株安丝菌素积累提高的原因。【结果】得到2株进化菌株Str16-4-4和Par16-2-1,发酵7d后AP-3产量分别提高了33.4%和31.7%,添加甜菜碱后其AP-3产量相比出发菌株提高了54.6%和47.4%。【结论】通过适应性进化的策略获得了AP-3生产能力提高的珍贵束丝放线菌橙色亚种进化菌株,对促进AP-3的生产提供了新思路,而且为适应性进化策略提高目标产物的产量提供了新的例证。