回转对COL1A1-EGFP基因表达的影响

研究微重力对COL1A1(Ⅰ型胶原α1链基因)启动子活性的影响,探讨微重力对成骨细胞相关基因表达影响的作用机制.将长为3.6 kb COL1A1启动子双酶切,获得不同长度的启动子片段,并与报告基因EGFP(增强型绿色荧光蛋白)连接,转染ROS17/2.8细胞,用G418筛选,得到稳定转染COL1A1-EGFP基因的ROS17/2.8细胞株.利用回转器模拟微重力效应,体外培养条件下,观察各细胞株报告基因的表达情况.结果显示细胞在模拟微重力下培养24,48 h后,报告基因EGFP和Ⅰ型胶原的表达升高,表明COL1A1启动子活性增强.说明短期模拟微重力条件下,成骨细胞能通过增强COL1A1启动子活性,代偿性提高Ⅰ型胶原的表达.     

CYP7A1基因-204位点A/C变异对启动子活性的影响

CYP7A1（cholesterol 7α-hydroxylase ）在胆固醇向胆汁酸代谢途径中起着至关重要的作用.为研究该基因启动子区-204位点A/C多态性是否影响基因表达, 利用荧光素酶作为报告基因,将含有A或C等位基因的启动子区片段分别正向和反向插入不含启动子的pGL3 basic质粒载体中,再以重组体转染4种细胞株,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定酶活性并进行比较.实验结果表明,2种基因型的正向序列启动子活性均高于相应的反向序列,含有A等位基因的启动子片段活性比含有C等位基因的片段低约1/3.TRANSFAC数据库分析显示,当-204位点等位基因为C时,可能存在1个Zic3结合位点.研究结果提示,CYP7A1基因启动子区-204位点A/C变异可减少启动子活性从而影响基因表达,其原因可能为1个潜在的Zic3结合位点的丧失.     

神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.     

人Ⅰ型胶原基因第一内含子调节转录的研究

人Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链(COLⅠA1)基因内含子序列在不同细胞内有不同的转录调节活性.报道了含人COLⅠA1基因内含子Ⅰ不同区段(+544～+855和+820～+1 093)的重组质粒pSCEP-CAT和pSCIP-CAT的构建并转染人胚肌腱成纤维细胞和Tca 8113舌癌细胞.地高辛标记抗CAT-ELISA检测结果显示:pSCEP-CAT在两种细胞均获表达;pSCIP-CAT在人成纤维细胞未表达,但在舌癌细胞其表达量明显高于pSCEP-CAT.这表明人COLⅠA1基因内含子Ⅰ+544～+855区段增强氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达;+820～+1093区段则抑制人成纤维细胞但显著增强舌癌细胞的CAT表达.     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体(FXR)基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,-1651~ 200、-1496~ 200区域的启动子活性无明显区别,-847~ 200区域的启动子活性最高,-544~ 200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在-847~-544范围内.     

棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2核心启动子区缺失分析

CYP9A17v2的过量表达与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为了研究CYP9A17v2表达调控机制, 对CYP9A17v2核心启动子区域的功能进行了分析;构建了含荧光素酶报告基因和CYP9A17v2启动子不同长度缺失片段(-1 095~+43)的重组质粒, 转染Sf9细胞瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。功能分析结果表明: 所有的7个缺失片段均具有启动子活性, -197~+43启动子区域的转录活性最高。在CYP9A17v2基因5′-调控区-197~-113区域内可能存在转录增强因子的结合位点, 而在-1 095~-197区域内可能存在转录抑制因子的结合位点。本研究为探索棉铃虫CYP9A17v2过量表达的转录调控机理奠定了重要基础。     

HE4荧光素酶报告基因载体构建与鉴定及其在肾脏纤维化中的作用

目的:通过构建HE4荧光素酶报告基因载体以及质粒转染以分析HIF-1α对HE4靶向调控,明确HE4调控肾脏纤维化的分子机制。方法:采用巢式PCR扩增HE4启动子片段,纯化酶切后定向克隆进p GL-3basic报告基因载体,进而与PRL-TK质粒共转染HK2细胞,检测荧光素酶的表达HIF-1α过表达质粒转染HK2细胞,western blot检测HE4分子的表达。HK2细胞转染HE4过表达质粒后检测COL4A1、COL1A1分子的表达。结果:获得HE4启动子荧光素酶报告载体,酶切鉴定结果与初期预测一致,荧光素酶检测结果证实HIF-1α可结合于HE4启动子上,从而启动HE4的表达。HK2细胞转染HIF-1α正义过表达质粒,HE4的m RNA和蛋白水平均显著增加。HK2细胞转染HE4过表达质粒,COL4A1、COL1A1表达水平上调。结论:本研究成功构建HE4启动子荧光素酶报告基因载体,证实HIF-1α为HE4上游靶基因,过表达的HE4可能通过上调COL4A1、COL1A1促进细胞外基质沉积促进肾脏纤维化的发生发展。     

人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究

目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。     

人SCF基因5′旁侧-1190～- 853 AT富集区功能研究

 已有的报告基因和EMSA实验研究表明 ,人干细胞生长因子 (SCF)基因 5′旁侧AT富集区- 1 1 90～ - 853在HeLa和MCF 7细胞中均能增强下游基因转录 ,可能为一个核基质结合区(MAR) ,对人SCF基因的转录发挥调控作用 .为进一步研究该AT富集区的功能 ,将人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区分别克隆入SV40或CMV启动子前后紧接着CAT报告基因 ,瞬时转染Jurkat,HepG2和 3T3细胞 ,检测CAT报告基因的瞬时表达活性 .结果表明 :人SCF基因 5′旁侧- 1 1 90～ - 853AT富集区在Jurkat和HepG2细胞中 ,对分别由SV40和CMV启动子引导的CAT基因表达均有抑制作用 ;但在 3T3细胞中对SV40启动子的转录活性表现出增强作用 ,对CMV启动子的转录活性无明显影响 .这些结果提示 ,人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区转录调控具有组织细胞特异性 ,在不同的细胞中可能发挥转录增强或抑制作用     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体（FXR）基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,－1　651～+200、－1　496～+200区域的启动子活性无明显区别,－847～+200区域的启动子活性最高,－544～+200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在－847～－544范围内.     

活化素抑制大鼠垂体GH_3细胞中人生长激素基因启动子的活性

本研究旨在探讨活化素(activin)对大鼠垂体GH3细胞中人生长激素(hGH)基因启动子活性的影响及其可能的调节机制。采用荧光素酶报告基因方法。首先建立含hGH基因启动子(-484～+30bp)和荧光素酶融合基因的稳定转染GH3细胞株,然后加入活化素或同时加入活化素与相关信号转导途径的激动剂,通过检测细胞培养液和细胞裂解液中GH的含量,以及GH3细胞内荧光素酶的变化,反映活化素对GH分泌、合成和hGH基因启动子活性的影响。将含不同长度hGH基因启动子序列的荧光素酶表达质粒分别转染GH3细胞,观察它们对活化素的反应,寻找活化素影响hGH基因启动子活性的关键DNA序列。结果表明,活化素(5,50nmol/L)能抑制大鼠垂体GH3细胞中GH的分泌和合成,活化素(5,50nmol/L)还能够抑制GH3细胞中hGH基因启动子的活性,使之仅达对照组的77%和69%;在胞内信号转导激动剂中,丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK/MEK)特异性激动剂C6ceramide(1μmol/L)完全取消了活化素对hGH基因启动子活性的抑制作用;活化素发挥抑制作用所需要的hGH基因启动子关键序列位于-132～-66bp之间。上述研究表明,活化素能抑制大鼠垂体GH3中hGH基因启动子的活性,它可能是通过抑制细胞内依赖MAPK的信号转导途径来完成的,同时hGH启动子上-132～-66bp的序列在其中发挥重要的作用。     

人A4GNT基因5'调控区的结构和功能分析

为探索人α1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α1,4-N-acetylglucosaminyltransferase,A4GNT)基因表达的调控机制,应用5'cDNA末端快速扩增法和引物延伸法确定了A4GNT基因的转录起始位点.在生物信息学分析的基础上,构建了系列5'缺失荧光素酶报告基因载体和定点突变载体.瞬时转染胃癌细胞MKN45和AGS.荧光素酶活性分析表明,A4GNT基因转录的核心启动子在-141bp～+116bp区域,该区域缺乏典型的TATA盒,但含有CCAAT盒、Sp1和ETS-1等转录因子潜在结合位点.突变分析显示,-136bp～-131bp的Sp1结合位点及-93bp～-89bp正向CCAAT序列对A4GNT启动子转录激活至关重要.电泳迁移率变动分析表明,这两个顺式作用元件能够与转录因子Sp1和NF-Y结合.另外,在-1464bp～-771bp区域可能含有与基因的特异性表达相关的调控元件.     

血管紧张素Ⅱ受体阻断剂对肾小球系膜细胞及I型胶原基因启动子的抑制作用

目的:探讨血管紧张素Ⅱ受体阻断剂在体外对肾小球系膜细胞及I型胶原基因启动子的作用。方法:大鼠肾小球系膜细胞株传代培养。BrdU掺入系膜细胞,加入各浓度los24小时后,经固定、变性及抗BrdU酶标抗体作用,ELISA法测定洛沙坦对细胞增殖的影响。FuGENE转染试剂转染系膜细胞,CAT-ELISA测定洛沙坦对两种重组体的影响。结果:在10%血清浓度1640培养基条件下,洛沙坦作用浓度从10-7-10-5M作用24小时后各组细胞增殖差异显著。洛沙坦作用于两种重组体24小时后,CAT测定结果提示:两种重组体转染细胞后,洛沙坦组与对照组的CAT值,差异也有显著性。结论:血管紧张素Ⅱ受体阻断剂洛沙坦对肾小球系膜细胞增殖有明显的抑制作用,并对I型胶原基因启动子具有负性调控作用。     

人ACT1基因P7启动子的克隆及序列分析

克隆并测定人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)基因P7启动子的序列,进一步探讨ACAT1基因表达的转录调控特点并分析其特异性转录位点。根据GenBank数据库提供的人A- CAT1基因P7启动子核苷酸序列,应用PCR方法从人单核细胞系THP-1扩增分离出ACAT1基因P7启动子全长片段,将PCR产物克隆入T载体,并对所获得的序列进行生物学信息分析。经琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定,克隆的ACAT1基因P7启动子片段碱基序列与Gen Bank数据库一致。成功克隆了ACAT1基因P7启动子,为研究在动脉粥样硬化过程中AcAT1基因的转录调控机制奠定基础。     

人LCRG1基因启动子的鉴定与初步分析

Laryngeal carcinoma related gene 1(LCRC1)是一个喉癌候选抑瘤基因,为进一步深入研究其转录调控机制,应用5'RACE技术确定了该基因的转录起始位点,然后在对人LCRG1基因进行生物信息学分析的基础上,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了11种含不同长度LCRG1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,-169～ 127区域的启动子活性最高.研究提示,LCRG1基因转录所必需的基因启动子序列在-169～ 127范围内.     

基因标记、转化、表达与检测

922444 通过诱导T7 RNA聚合酶强烈抑制氯霉素乙酰转移酶的表达[英]/Kim,H.B.…∥Biotechnol.Lett.-1991,13(10).-751～754[译自DBA,1991,10(25),91-14511] 通过诱导大肠杆菌中的噬菌体T7表达系统强烈抑制氯霉素乙酰转移酶的表达。消化了质粒pYEJ001(含带有大肠杆菌核糖体结合位点序列的无启动子cat基因)和质粒pGEM3(带有T7和SP6启动子),将连接混和物导入大肠杆菌。含由T7和SP6启动子调控的cat基因的质粒分别称为pT7CAT和pSP6CAT。即使在无RNA聚合酶条件     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

人肠组织特异抗原A33基因5′调控区的克隆及其功能分析

用基因组步行法 (genomewalker)克隆了人A33抗原基因的 5′调控区 94 0bp片段 ,并用PCR法鉴定了这一克隆的正确性 .将该序列提交GenBank ,登录号为AF2 0 0 6 2 6 .用引物延伸法 (primerex tension)确定了A33基因的转录起始位点 ,发现该位点位于一个TATA盒下游 10个碱基处 .以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建了不同长度的A33启动子 5′缺失载体 ,用脂质体介导的方法将这些载体转染LoVo、HeLa、2 93等细胞 ,比较了EGFP的表达水平 .研究发现 ,A33启动子上主要转录调控元件以及与组织特异性表达相关的转录调控元件位于A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域     

人肠组织特异抗原A33基因5′调控区的克隆及其功能分析

用基因组步行法 (genomewalker)克隆了人A33抗原基因的 5′调控区 94 0bp片段 ,并用PCR法鉴定了这一克隆的正确性 .将该序列提交GenBank ,登录号为AF2 0 0 6 2 6 .用引物延伸法 (primerex tension)确定了A33基因的转录起始位点 ,发现该位点位于一个TATA盒下游 10个碱基处 .以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建了不同长度的A33启动子 5′缺失载体 ,用脂质体介导的方法将这些载体转染LoVo、HeLa、2 93等细胞 ,比较了EGFP的表达水平 .研究发现 ,A33启动子上主要转录调控元件以及与组织特异性表达相关的转录调控元件位于A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因形插入质粒pGL3-hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hWp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有形mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达,提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件．