转基因动物技术及其若干问题

转基因动物是用基因工程技术,将外源目的基因经由生殖细胞或早期胚胎导入动物胚胎染色体基因组内,使之稳定整合并能传给后一代的动物。被导入的外源目的基因称为转基因。经转基因操作成功的受精卵或胚胎所发育的第一代个体称为首建者。1974年Jaenisch等首次报道应用显微注射法将SV40注入鼠胚胎获得第一例嵌合型转基因小鼠。至今,转基因动物     

以精子为载体的体外转基因猪胚胎研究

去精清精子与外源DNA共孵育,使其携带外源DNA,再与成熟卵母细胞进行体外受精,生产转基因猪胚胎,为通过胚胎移植生产转基因猪奠定基础。结果:通过PCR从不同时期胚胎中检测出携带外源DNA的阳性胚,说明精子与外源DNA共孵育能使精子携带外源DNA,并通过体外受精技术使外源DNA进入早期胚胎。     

外源基因对精子的影响及其在山羊早期胚胎中的表达

摘要: 在前期实验中发现, 山羊精子可自发结合外源DNA, 但结合能力在不同动物个体之间差异显著。挑选结合能力明显不同的3只公羊, 进一步探讨了外源DNA对精子的影响及其在早期胚胎中的表达, 结果发现: 外源基因与精子共同孵育后, 精子的活率、顶体反应发生率和受精能力均呈下降态势, 其降幅与精子的结合能力密切相关。利用与DNA共育后的精子进行体外受精, 外源基因可被导入卵母细胞并在早期胚胎中获得表达, 但胚胎阳性率因精子供体不同而差异显著(P<0.05); 其中来源于高、中结合能力供体生产的胚胎, 分别有16.2%(25/154)和5.3%(4/76)可检测到外源基因存在, 但表达仅见于高结合能力供体生产的早期胚胎, 表达率为6.5%(10/154); 低结合能力供体生产的胚胎无外源基因。研究表明, 在以精子载体方法生产转基因动物的实验过程中, 筛选对DNA结合能力较强的精子供体是提高转基因效率的前提, 但需要考虑外源DNA对精子受精能力的影响。     

花粉作为外源基因媒介的植物遗传转化

以花粉作为外源DNA的媒介,获得转基因植株是有潜力的遗传转化体系。它可避免离体培养过程中的遗传变异和转基因植株的嵌合现象。本文介绍以花粉为外源基因的载体,利用植物有性生殖过程和小孢子胚胎发生两条途径进行植物遗传转化的研究进展。     

精准高效外源DNA整合技术研究进展

精准高效整合技术是将外源DNA片段插入到目的细胞基因组特定位置的一项转基因技术。早期通过细胞基因组与外源DNA同源序列发生重组来完成靶向整合的目的。伴随基因编辑技术发展,特别是CRISPR/Cas9技术的出现,精准高效的外源DNA整合技术日益成熟,广泛应用到功能基因组学、转基因动物及遗传疾病治疗的研究中。围绕基因编辑研究进展、引导RNA修饰技术、单碱基整合技术、转座子技术和外源DNA整合效率等方面对精准靶向和高效整合技术进行综述。     

E.coli galk和gpt基因重组质粒(pIDB103)导入金鱼受精卵内的研究

用显微注射法把含有E.coli galk和gpt基因的环状和线状重组DNApIDB103分别导入金鱼受精卵的细胞质内。这些注射过的卵子一般都能正常发育。从各不同发育时期的胚胎分离DNA与~(32)P标记的pIDB103探针杂交表明,导入的环状外源重组DNA在胚胎发育的早期,绝大部分以各种环状构型存在。从原肠胚晚期开始,它们逐渐形成串联状高分子量DNA。在尾芽期仍能检测到它们的序列。但尚未证明,它们是否与受体的染色体DNA发生整合。我们从囊胚期的胚胎中回收到了能转化大肠杆菌的环状重组DNA,它的酶切图谱和pIDB103极其相似。导入金鱼受精卵内的线状重组质粒pIDB103,除少量DNA与金鱼的染色体DNA可能发生整合外,其余绝大部分也形成高分子量DNA。     

哺乳类早期胚胎发育阻滞的形成与突破

本文对有关哺乳类(包括人)着床前早期胚胎发育阻滞的形成与突破的研究近况作了概述。早期胚胎发育阻滞一般都发生在最初四个细胞周期中的某个长G_2相阶段,该时期恰好是贮存在胚胎细胞中源自母系的mRNA失活或降解、胚胎细胞自身基因组应该被激活的临界期,胚胎在这时对环境压力非常敏感。过氧化氢类物质在胚胎细胞内高含量累积也是导致发育阻滞的因素之一。早期胚胎的正常发育必须依赖于源自生殖道上皮细胞的信号,这类外源信号被初步认为蛋白质性质。提供某些生长因子,或清除微环境中有害物质等都将有助于 胚胎的正常发育。早期胚胎间的协同作用在体外胚胎正常发育中的正效应已引起人们的重视。     

转基因动物研究现状

导言 1980年Gordon等人将疱疹病毒胸苷激酶基因和SV40早期基因启动子重组到质粒pBR322中,再由显微注射植入小鼠受精卵原核,获得第一只转基因小鼠。原理上任何克隆基因都能永久并入哺乳动物胚胎基因组。显微注射后,外源DNA整合进细胞,随后繁衍成种系。因此通过选育能永久建立携带一个或多个新基因的动物谱系。“转基因”(Transgenic)一词应运而生。在此之前,Jaenisch(1976)观察到逆转录病毒(又称逆病毒)感染小鼠胚胎,使单个前病毒DNA插入小鼠染色体DNA。而后含异源基因的重组感染性逆病毒系统的发展导致了用     

供体细胞在鸡—麻鸭嵌合体胚胎中的发育

用微注射法将鸡的PGCs注入到麻鸭的胚盘下腔中,用鸡W染色体DNA探针通过原位杂交对供体细胞在嵌合体胚胎中的发育作了研究,54个胚胎各器官都有不同程度的嵌合,其中肝脏的嵌合率最高,性腺最低,胚盘细胞移植可制备鸡－麻鸭的体细胞和种系嵌合体。     

生产转基因动物的技术现状

用实验手段,可将特定外源基因导入早期胚胎的细胞,由此整合到染色体上,还可通过被整合动物的生殖细胞系传给子代。这类整合外源基因的“新动物”被统称为转基因动物(Transgenic Animals)。 按人为意愿设计生产转基因动物,能达到如下若干目的:1)将理想的遗传物质导入动物染色体,以扩大种内遗传变异,迴避有性繁     

研究哺乳动物早期胚胎发育与分化的ES细胞途径

ＥＳ细胞即胚胎干细胞,它是由哺乳动物附植前早期胚胎的内细胞团细胞体外分离培养而建立的。其特点是只生长,不分化,并保持发育的多能性。作为一种理想的模型系统与有用的工具,可用于研究哺乳动物早期胚胎的发育与基因的表达。本文从以下四个方面分述了ＥＳ细胞的具体应用及其研究进展：１）探讨早期胚胎生长发育的条件;２）研究胚胎组织分化的发生及其诱导;３）用ＥＳ细胞与正常胚胎细胞在体外重建胚胎;４）ＥＳ细胞体外定位整合外源ＤＮＡ。     

早期转基因兔胚的培养及外源基因滞留的研究

用显微注射法导入外源Smtpgh基因的早期免胚进行体外培养,并用PCR技术对单个胚中的外源基因进行了检测,以探讨SMTPGH基因在早期免胚中的滞留情况。研究结果表明早期转基因免胚在Tcl99+10％Fcs培养液中有75％发育到囊胚期;其外源基因在8细胞期前没有丢失,随后有逐渐丢失的现象。到胚胎的发育后期,其外源基因的滞留率接近于整合率。     

睾丸内注射pEGFP-N1体内转染精子并在山羊早期胚胎成功表达

目的探讨睾丸内注射法pEGFP-N1在精细胞的整合和在早期胚胎中表达.方法选择4头本地山羊,双侧睾丸注射不同剂量质粒DNA pEGFP-N1,注射后PCR和Southern杂交检测pEGEP-N1在精子中的整合.结果pEGFP-N1整合到精子基因组中,转染效率最高发生在注射后第40天,转染阳性率最高为81%;绿色荧光蛋白在精子及其体外受精的部分胚胎中表达,胚胎阳性率最高的达66.7%.结论通过睾丸内注射pEGFP-N1能整合进入精子基因组,并能通过体外受精在山羊早期胚胎中表达;睾丸内注射法可能是一种可行、简单并利于推广的制备转基因山羊的方法.     

氯化钠密度梯度离心法制备用于显微注射的外源DNA片段

DNA显微注射是生产转基因动物最可靠和最常使用的一种方法,外源DNA的纯度对显微注射的成功起着至关重要的作用。本文介绍用氯化钠密度梯度离心的方法制备用于显微注射的外源DNA片段。与传统的琼脂糖凝胶回收的方法相比较,用此方法制备的外源DNA片段对小鼠受精卵进行显微注射后,受卵体母鼠的胚胎存活率,以及子代小鼠的外源基因整合率均有明显的提高。这一方法可为进一步提高转基因动物的成功率,提供方法学上的参考。 Abstract:DNA microinjection is the most popular and reliable method of producing transgenic animals.The purity of foreign DNA plays an important role for the success of microinjection.In this study,we introduced the use of sodium chloride step gradients in fractionating foreign DNA fragment for microinjection.The data demonstrated that,compared with the conventional agarose gel extraction method,NaCl purification scheme of toreign DNA could improve the treated embryo survival and foreign DNA intergration rate markedly.     

外源DNA在动物体内的吸收代谢

综述了外源DNA在动物体内组织和细胞的代谢命运。外源DNA经核酸酶不完全降解后可以通过胃肠道被哺乳动物吸收,外源DNA片段能够被哺乳动物细胞吸收并整合到宿主细胞基因组中。     

慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白转基因标记法研究猪嵌合体制作

目的:通过建立慢病毒载体感染猪胚胎体系实现胚胎标记,进而研究不同发育阶段猪孤雌胚胎之间的嵌合能力,为进一步研究猪早期胚胎发育以及细胞分化奠定基础.方法:首先,通过显微注射的方法把2×109I.U./ml、2×108I.U./ml和2×107I.U./ml三个梯度的表达绿色荧光的慢病毒载体分别注射到猪1-细胞胚胎和2-细胞胚胎的透明带下,进行胚胎的GFP转基因标记,在荧光显微镜下观察比较卵裂率、阳性胚胎率、囊胚率、阳性囊胚率和囊胚细胞数.然后,采用凹窝聚合法对同步发育胚胎在不同阶段(2-细胞,4-细胞,8-细胞)进行嵌合,2-细胞胚胎与不同发育阶段(2-细胞、4-细胞、8-细胞)胚胎进行嵌合以及2-细胞胚胎卵裂球互换制作嵌合体胚胎,发育到囊胚时在荧光显微镜下检测胚胎的嵌合状态.结果:2×109I.U./ml的慢病毒感染猪2-细胞胚胎组中,体外受精和孤雌胚胎感染阳性率( 80.00％、76.36％)和阳性囊胚率(90.74％、89.56％)都显著高于其它滴度组(P＜0.05),另外,慢病毒感染的两种胚胎与对照组对卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数三个指标没有显著影响(P＞0.05).2-细胞胚胎之间嵌合囊胚率和2-细胞卵裂球互换嵌合囊胚率( 53.85％、62.50％)显著高于2-细胞胚胎与4-细胞胚胎的嵌合率(18.60％,P＜0.05),在同步发育胚胎中8-细胞胚胎之间的嵌合率(75.00％)高于4-细胞胚胎之间和2-细胞胚胎之间的嵌合率( 65.00％、53.80％).结论:2×109I.U./ml的慢病毒感染2-细胞期胚胎效率最高,另外,慢病毒感染对猪胚胎发育没有明显影响.8-细胞间的嵌合率比较高;发育同步胚胎间的嵌合率高于发育非同步胚胎间的嵌合率.     

植物细胞内外源基因的瞬间表达及其在基因表达调控研究中的应用

外源DNA通过物理或化学的方法导入植物原生质体后,在合适条件下,短时间内即可诱导所携带的基因表达。这种基因的瞬间表达受到导入外源基因的方法、DNA的状态及所构建的嵌合基因的结构、植物细胞本身的生理状态等因素的影响。目前这一瞬问表达系统已广泛应用于植物基因表达的调控研究。     

源于129S1品系的小鼠胚胎干细胞系的建立及其生物学特性分析

从129S1小鼠早期胚胎的内细胞团分离、培养类胚胎样细胞,经反复传代,成功地建立了129S1小鼠胚胎干细胞系,命名为NM-2细胞系。形态学鉴定具有胚胎干细胞的典型形态特征,正常核型率为80％;呈碱性磷酸酶阳性、表达胚胎干细胞特异性转录因子OCT-4;体内分化后可形成源于三胚层的组织结构;经囊胚腔显微注射后所获得的子代个体中79％具有毛色嵌合表型;雄性嵌合个体中31％发生生殖腺嵌合;同时,通过育种观察到所有生殖腺嵌合体的子代小鼠表型正常。以上结果证实NM-2细胞系为一株具高生殖腺嵌合能力的小鼠胚胎干细胞系。     

花粉作为外源基因媒介的植物遗传转化

以花粉作为２外源ＤＮＡ的媒介,获得转基因植株是有潜力的遗传转化体系,它可避免离体培养过程中的遗传变异和转基因植株的嵌合现象。本文介绍以花粉为外源基因的载体,利用植物有性生殖过程和小孢子胚胎发生两条途径进行植物遗传转化的研究进展。     

未来水稻遗传工程中的有利抗性基因

从技术上来讲,水稻基因工程是可行的,目前嵌合基因结构体能被整合至水稻细胞的核DNA中,具有原基因的重组细胞可再分化出植株;外源基因变成了水稻基因组的一个组分,它们可在再生植株上表达开遗传至下一代。外源基因整合位点一般是随机的,它可编码一种新蛋白或改变原受体细胞蛋白质的合成水平及位置。不过将外源基因命中至水稻基因组中的特定位点或借助工程法代替一个原有基因的技术还未达实用水平。未来的工作是增进现有转化技术的可靠性和有效性或扩大技术应用的品种范围,目前许多研究正集中在鉴定可导入水稻并表现出新的有利农艺、营养和商品价值性状的基因结构。