多重耐药黏液型铜绿假单胞菌 氨基糖苷类修饰酶基因检测

摘要：目的 研究多重耐药黏液型铜绿假单胞菌（MDR-mPA）氨基糖苷类修饰酶基因的分布,为合理应用抗生素提供依据。方法 采用纸片扩散（K-B）法对临床分离的MDR-mPA进行药敏试验,用聚合酶链反应（PCR）法检测氨基糖苷类修饰酶。结果 61株MDR-mPA中共有23株检出氨基糖苷类修饰酶,其中aac(3)-Ⅱ阳性12株（48%）,aac(6′)-Ⅱ阳性9株（36%）,aac(6′)-Ⅰ阳性3株（12%）,ant(2″)-Ⅰ阳性1株（4%）。结论 黏液型铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药与氨基糖苷类修饰酶基因表达有关。     

多药耐药铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶和16S rRNA甲基化酶基因分析

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌对氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类抗菌药物耐药情况、氨基糖苷类耐药相关基因和16S rRNA甲基化酶基因存在情况以及菌株之间的亲缘性。方法采用琼脂稀释法测定临床分离的30株铜绿假单胞菌对7种临床常用于治疗铜绿假单胞菌感染的抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应分析氨基糖苷类修饰酶、16S rRNA甲基化酶基因型及其他基因型,运用SPSS统计分析软件对菌株样本亲缘性做聚类分析。结果30株铜绿假单胞菌对临床常用抗生素的耐药率分别是奈替米星70%、妥布霉素63.3%、庆大霉素63.3%、环丙沙星53.3%、亚氨培南40%和阿米卡星13.3%,而多黏菌素B的耐药率为0。21株氨基糖苷类耐药菌株中（其中20株为多药耐药菌株）,氨基糖苷类耐药基因型aac（6＇）-Ⅰ阳性13株（61.9%）、aac（6＇）-Ⅱ阳性13株（61.9%）、ant（2＇＇）-Ⅰ阳性10株（47.6%）、ant（3＇＇）-Ⅰ阳性9株（42.9%）、aac（3）-Ⅱ阳性1株（4.8%）,另有1株菌oprD2基因缺失,未检出基因型aac（6＇）-Ⅰae、aph（3＇）-Ⅲ、aac（6＇）-aph（2＇＇）和ant（4＇）-Ⅰ;16S rRNA甲基化酶基因rmtA基因型阳性19株（90.4%）、armA基因型阳性有8株（38.1%）,未检出基因型rmtC、rmtD。聚类分析结果显示分离的菌株中存在克隆传播。结论大部分测试的铜绿假单胞菌对临床常用的铜绿假单胞菌抗感染药物已产生广泛耐药,尤其对氨基糖苷类抗生素。这些菌株的氨基糖苷类修饰酶常见耐药基因型检出率高,16SrRNA甲基化酶基因型rmtA和armA的检出率亦较高。30株测试菌株中存在克隆传播。     

质粒介导的大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药机制的研究

目的了解临床分离的耐环丙沙星的大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮类耐药基因的携带情况,并进行相关耐药机制的分析。方法采用VITEK-2全自动微生物检测系统鉴定细菌,用K-B法检测细菌对16种常用抗生素的敏感性,采用聚合酶链反应检测喹诺酮类耐药基因qnrS、qnrA、qnrB、qepA和aac（6′）-Ib,并对阳性的aac（6′）-Ib结果进行测序分析。结果 30株耐环丙沙星的大肠埃希菌中,2株（6.67%）检出qepA基因,8株（26.67%）检出aac（6′）-Ib基因,经测序证实其中6株为aac（6）′-Ib-cr（20.0%）。未检出qnrS、qnrA和qnrB基因。结论对环丙沙星耐药的大肠埃希菌携带aac（6′）-Ib-cr和qepA基因,引起质粒介导的对喹诺酮类抗菌药物的低水平耐药。     

对一株铜绿假单胞菌22种耐药基因的研究

目的研究铜绿假单胞菌多重耐药情况和相关机制。方法采用聚合酶链反应（PCR）法对一株多重耐药铜绿假单胞菌进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶（AMEs）基因、喹诺酮类耐药基因、耐消毒剂基因（qacE△1-sul1）和整合酶基因检测,并对VIM基因进行了测序。结果PCR扩增结果显示该菌株aac（6′）-Ⅰb、blaCARB、gyrA、oprD2、ant（2″）-Ⅰ、qacE△1-sul1、blaIMP-I、blaTEM、blaVEB、aac（3）-Ⅱ、ant（3″）-Ⅰ、intⅠ1、blaVIM基因均为阳性,而aac（3）-Ⅰ、aac（6′）-Ⅱ、blaGES、blaGIM、blaOXA-10群、blaPER、blaSPM、blaSHV、blaDHA基因均为阴性,VIM基因扩增产物测序后经BLAST同源性分析表明为VIM-2型。结论铜绿假单胞菌存在多重耐药基因。管壁涂有季胺类、双胍类消毒剂和磺胺的II代导管的抑菌效果需重新评价。     

铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因探讨

目的了解浙江省丽水地区铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)临床分离株中氨基糖苷类修饰酶(aminoglycoside-modifying enzymes,AMEs)基因存在状况。方法从分离的40株Pa中,用微量稀释法测定其对3种氨基糖苷类抗生素的敏感性,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析AMEs基因{aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ、aac(6')-Ⅱ、ant(3")-Ⅰ、ant(2")-Ⅰ}类型。结果40株Pa分离株中ant(2")-Ⅰ和aac(6')-Ⅱ基因阳性率分别为52.5%和45.0%,未检出aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ、ant(3')基因类型。结论丽水地区耐氨基糖苷类抗生素的铜绿假单胞菌存在ant(2")-Ⅰ和aac(6')-Ⅱ基因,且Pa对氨基糖苷类抗生素耐药严重,应注意对其进行临床检测和监控。     

多重耐药鲍曼不动杆菌氨基糖苷类修饰酶与16S rRNA甲基化酶基因的研究

了解氨基糖苷类修饰酶、16S rRNA甲基化酶基因在多重耐药鲍曼不动杆菌中的流行情况。收集2014年12月至2015年3月厦门大学附属成功医院住院患者临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌共28株,采用VIKET Compact 2全自动细菌鉴定系统进行细菌鉴定,应用纸片扩散法(K-B法)检测鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药性,采用聚合酶链反应(PCR)法检测氨基糖苷类修饰酶、16S rRNA甲基化酶基因。结果显示,多重耐药鲍曼不动杆菌除对头孢哌酮/舒巴坦耐药率为21.4%外,对其他所测药物耐药率均50%,本组28株多重耐药鲍曼不动杆菌共检出5种氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3')-Ⅰ和1种16S rRNA甲基化酶基因arm A,阳性率分别为85.7%(24株)、7.14%(2株)、67.8%(19株)、92.9%(26株)、53.6%(15株)和82.1%(23株)。氨基糖苷类修饰酶、16S rRNA甲基化酶耐药基因是多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类耐药的重要原因。     

大连市伤寒沙门菌耐药性及耐药基因分析

目的检测多重耐药伤寒沙门菌对抗菌药物的敏感性及其耐药基因携带情况,为伤寒沙门菌引起的腹泻治疗提供科学依据。方法采用微量肉汤稀释的方法测定大连地区临床分离的78株伤寒沙门菌对12种抗生素的敏感性;用PCR方法检测TEM型β内酰胺酶基因、catA和catB氯霉素乙酰基转移酶基因以及cmlA氯霉素外排泵蛋白基因、aac(6′)Ⅰb和aac3Ⅱ型氨基糖苷类修饰酶基因、qacEΔ1sul1耐消毒剂和磺胺基因、多重耐药外排基因acrB等8种耐药基因。结果78株沙门菌对12种药物有不同程度耐药(1.28%~74.35%)。得到9株多重耐药菌株,其中5株检出TEM型β内酰胺酶基因;7株耐氯霉素的伤寒沙门菌菌株中,2株仅检出catA基因,1株仅检出catB基因,1株仅检出cmlA氯霉素外排泵蛋白基因,2株同时检出catA基因和cmlA氯霉素外排泵蛋白基因;2株检出aac(6′)Ⅰb基因,1株检出aac3Ⅱ型氨基糖苷类修饰酶基因;4株检出耐消毒剂和磺胺基因qacEΔ1sul1;6株检出多重耐药外排基因acrB。结论大连地区临床分离的伤寒沙门菌存在严峻的耐药现象,多种耐药基因存在于耐药伤寒沙门菌中,可能是导致菌株对多种抗菌药物耐药的原因。     

整合子与多重耐药大肠埃希菌相关性研究

目的探讨整合子在多重耐药大肠埃希菌耐药性中的作用。方法对临床分离的93株多重耐药大肠埃希菌的I、Ⅱ型整合酶基因进行检测,并分析药敏结果。结果多重耐药临床分离株中Ⅰ型整合子阳性率为60.2%。所检出整合子共有3种长度即1000、1600和2000 bp;主要携带aadA和dfrA类基因盒;未检出Ⅱ型整合子。结论整合子形成是细菌产生多重耐药的重要原因。     

产ESBLs大肠埃希菌整合子及其相关基因盒的研究

目的检测产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌中整合子的整合酶及插入的相关基因盒情况,分析整合子对细菌耐药性的影响。方法采用K-B琼脂扩散法对45株临床分离的产ESBLs大肠埃希菌进行药敏试验;应用PCR法检测45株产ESBLs大肠埃希菌Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子;对Ⅰ类整合子阳性菌进行整合子相关基因盒检测。结果45株菌中有27株（60．0％）含有Ⅰ类整合子,没有检测到Ⅱ类和Ⅲ类整合子阳性菌。在Ⅰ类整合子阳性菌中,有23株携带Ⅰ类整合子相关基因盒（85．2％）,5种不同的基因盒图谱,片段大小在600～2322bp,分离自同一科室的部分菌株携带大小相同的基因盒;Ⅰ类整合子阳性菌株的耐药率高于整合子阴性的菌株。结论Ⅰ类整合子及整合子相关基因盒在产ESBLs大肠埃希菌株中分布广泛,整合子在细菌耐药中发挥作用。     

山东省某地区奶牛源大肠埃希菌的血清型、耐药特性及分子特性

【目的】旨在对从山东省某地区4个健康奶牛养殖场分离到的大肠埃希菌进行优势血清型、耐药特性、Ⅰ类整合子基因盒携带情况以及系统进化群分析。【方法】采集194份来自山东省某地区4个规模化奶牛场奶牛新鲜粪便样品,进行大肠埃希菌分离和鉴定,利用常用大肠埃希菌诊断血清进行血清型鉴定;利用10%的绵羊血平板检测溶血性;利用K-B法检测对14种常规抗菌药物的敏感性;利用聚合酶链式反应(PCR)检测革兰阴性菌常见的6大类24种耐药基因、Ⅰ类整合子基因盒结构并对目的条带测序分析;利用细菌多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术分析大肠埃希菌的ST型并使用eBURST v3软件分析菌株之间的克隆关系。【结果】从194份新鲜粪便样品中分离到171株大肠埃希菌,其中主要为致病性(19.9%)和侵袭性大肠埃希菌(17.0%),优势血清型分别为O128:K67(12/171)和O143:K7(12/171)。另外,具有溶血性的大肠埃希菌阳性率为9.4%(16/171);药敏试验结果显示多重耐药菌株的比率为22.2%,其中对氨苄西林耐药率最高为33.9%,四环素次之,为24.0%;PCR检测耐药基因和整合子结果显示,59.1%的菌株携带β-内酰胺类耐药基因blaTEM,59.1%的菌株携带氨基糖苷类耐药基因ant(2′),未检测到四环素耐药基因tetA和tetB;Ⅰ类整合子的阳性率为4.1%(7/171),dfrA12-aadA2-sul1为优势基因盒结构(4/171);MLST将大肠埃希菌分为8种ST型,其中,ST155(10/171)和ST58(45/171)形成一个克隆复合物且没有发现新的ST型。【结论】本研究证实,从该地区规模化健康奶牛场新鲜粪便中分离到的大肠埃希菌优势血清型为O128:K67和O143:K7;少部分大肠埃希菌具有溶血性;仅对氨苄西林、四环素等具有较高的耐药率;优势基因盒结构为dfrA12-aadA2-sul1;MLST分型显示不同奶牛场分离出亲缘关系较近的菌株,其分布具有多态性,血清型与ST型之间无相关性。本研究表明源自表观健康的奶牛的大肠埃希菌存在多重耐药现象,具有食品公共卫生安全隐患,该研究对于提升规模化奶牛场奶制品的安全生产与质量评估具有一定的理论指导意义。     

Aminoglycosides resistance in clinical isolates of Staphylococcus aureus from a University Hospital in Bialystok, Poland

Staphylococcus aureus obtained from a University Hospital in Poland were characterized in relation to resistance to aminoglycoside antibiotics and the distribution of the genes encoding the most clinically relevant aminoglycoside modifying enzymes (AMEs). Of a total of 118 S. aureus, 45 (38.1%) isolates were found to be resistant to at least one of the tested antibiotics. All aminoglycoside resistant isolates except one 44 (97.8%) were resistant to kanamycin. The majority of strains 37 (82.2%) and 32 (71.1%) expressed resistance to neomycin and tobramycin, respectively. Eleven strains (24.4%) were resistant to gentamicin or amikacin. All S. aureus strains were sensitive to netilmicin. The most prevalent resistance gene was aac(6')-Ie+aph(2') found in 13 (28.9%) strains and 12 (26.7%) isolates carried ant(4')-Ia gene, whilst aph(3')-IIIa gene was detected in only 7 (15.6%) isolates. Additionally, the ant(6)-Ia and str genes were detected in 14 (31.1%) and 2 (4.4%) strains, respectively. Ten (22.2%) strains resistant to amikacin, tobramycin, kanamycin or neomycin did not harbor any of the above-noted genes.     

纹带棒状杆菌耐药特征研究

分析我国山东地区临床分离的纹带棒状杆菌对常用药物的敏感性,并对其耐药机制进行探讨。收集该省某三甲医院临床样本,用哥伦比亚血平板培养基对纹带棒状杆菌进行分离培养,用微量肉汤稀释法检测12种常用抗生素对纹带棒状杆菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对耐药菌株的耐药基因[aph(3”)-Ⅰb、aph(6)-Ⅰd、aac(6’)-Ⅰb, tetW, ermX, gyrA]进行扩增、测序比对,以探讨相关的耐药机制。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)对耐药基因ermX、tetW进行定量分析,采用公式2^－ΔΔCt计算基因相对表达量差异倍数。结果显示,共分离出纹带棒状杆菌83株,且均为多重耐药菌。对万古霉素、利奈唑胺表现为完全敏感;对红霉素、环丙沙星、克林霉素表现出完全耐药,对四环素的耐药率为86.7%(72/83),对庆大霉素的耐药率为38.6%(32/83);ermX基因的检出率为100%(83/83),tetW基因的检出率为88.0%(73/83),aph(3”)-Ⅰb基因的检出率为36.1%(30/83),aph(6)-Ⅰd基因的检出率为37.3%(31/83),aac(6’)-Ⅰb基因的检出率为15.7%(13/83)。ermX和tetW基因的相对表达量均有所变化,但变化不明显。内在型耐药(cMLS)是菌株对红霉素耐药的潜在机制。结果提示,本研究调查医院的纹带棒状杆菌耐药严重,耐药谱较为广泛,须引起医院和实验室的重视。     

Characterization of glycopeptides, aminoglycosides and macrolide resistance among Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates from hospitals in Tehran

The prevalence of glycopeptides, aminoglycosides and erythromycin resistance among Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium was investigated. The susceptibility of 326 enterococcal hospital isolates to amikacin, kanamycin, netilmicin and tobramycin were determined using disk diffusion method. The minimum inhibitory concentration (MIC) of vancomycin, teicoplanin, gentamicin, streptomycin, and erythromycin were determined by microbroth dilution method. The genes encoding aminoglycoside modifying enzymes described as AMEs genes, erythromycin-resistant methylase (erm) and vancomycin-resistant were targeted by multiplex-PCR reaction. High level resistance (HLR) to gentamicin and streptomycin among enterococci isolates were 52% and 72% respectively. The most prevalent of AMEs genes were aac (6')-Ie aph (2") (63%) followed by aph (3')-IIIa (37%). The erythromycin resistance was 45% and 41% of isolates were positive for ermB gene. The ermA gene was found in 5% of isolates whereas the ermC gene was not detected in any isolates. The prevalence of vancomycin resistant enterococci (VRE) was 12% consisting of E. faecalis (6%) and E. faecium (22%) and all of them were VanA Phenotype. The results demonstrated that AMEs, erm and van genes are common in enterococci isolated in Tehran. Furthermore our results show an increase in the rate of vancomycin resistance among enterococci isolates in Iran.     

blacCTX-M基因与氨基糖苷类抗生素耐药水平的相关性

目的分析β-内酰胺类耐药基因在肺炎克雷伯菌中的分布并评估这些基因对抗生素耐药水平的影响。方法选择76株肺炎克雷伯菌临床分离菌株,用K—B纸片法和MIC法检测抗生素的耐药性;用PCR法检测肺炎克雷伯菌株中β－内酰胺类抗生素的相关基因,RT—PCR的方法检测13-内酰胺类基因的表达。结果76株肺炎克雷伯菌中,ESBLs相关基因主要为SHV（45／76,59．21％）、TEM（27／76,35．53％）和CTX—M（38／76,50．00％）;携带SHV基因菌株对阿米卡星的耐药率（37．78％）明屁高于非携带SHV基因菌株（16．13％）（P〈0．05）。携带CTX—M基因（76．32％）和TEM基因（70．37％）的菌株对庆大霉素的耐药率明显高于不携带CTX—M基因（34．21％）和TEM基因（46．94％）的菌株（P〈0．05）。RT—PCR的结果显示,阿米卡星和庆大霉素耐药株的CTX—M基因mRNA的表达率均明显高于敏感株。结论β-内酰胺类基凶与氨基糖苷类抗生素的耐药相关,CTX—M基因与肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗生素的耐药水平相关。     

痰液中产ESBL肺炎克雷伯菌Ⅰ、Ⅱ类整合子检测及基因分型研究

目的研究临床痰液分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌Ⅰ、Ⅱ类整合子分布情况,并进行基因分型。方法分离临床痰液中100株产ESBLs的肺炎克雷伯菌,用WHONET 5.4分析菌株药敏情况,PCR检测整合酶Ⅰ、整合酶Ⅱ,ERIC-PCR进行基因分型。结果 100株菌对碳青霉烯类敏感率100%,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类多数耐药。整合酶Ⅰ检出率为60%,未检出整合酶Ⅱ。100株菌分为72个基因型。结论Ⅰ类整合子广泛存在于产ESBLS肺炎克雷伯菌中,与肺炎克雷伯菌的耐药相关,ERIC-PCR可用于临床分离肺炎克雷伯的基因分型。     

禽源致病性大肠埃希菌的耐药性与中草药有效成分的抑菌活性测定

以28株合肥地区禽源致病性大肠埃希菌为实验材料,采用K-B纸片琼脂扩散法检测禽源致病性大肠埃希菌的耐药情况。同时采用平板打孔法测定盐酸小檗碱、绿原酸、靛玉红和丹参酮ⅡA 4种中草药有效成分的抑菌活性。结果表明,28株禽源致病性大肠埃希菌对17种抗菌药物均呈现不同程度的耐药性,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和喹诺酮类抗菌药物的耐药率分别介于0%～92.86%、14.29%～50.00%、78.57%～100%和57.14%～71.43%。中草药有效成分盐酸小檗碱和丹参酮ⅡA对大肠埃希菌具有较好的抑制活性,抑菌率分别为92.86%（26/28）和89.29%（25/28）。     

利用Bio-BglBrick方法表达紫杉醇生物合成酶

目的:进行紫杉醇药物生物合成前五步催化酶二磷酸盐合酶(GGPPS)、紫杉二烯合酶(TS)、紫杉二烯5α羟化酶(THY5α)、紫杉二烯5α-O-乙酰转移酶(TAT)和紫杉烷10β羟化酶(TDH)基因在大肠杆菌异源生物合成途径的组建及串联,实现单个表达及串联表达,并试图通过连续生物催化获得紫杉醇中间体紫衫二烯。方法:依据合成生物学中Brick基因组装方法,通过对载体pET30a的酶切位点进行定向改造,设计独特的BglⅡ/BamHⅠ和XbaⅠ/SpeⅠ串联表达盒,在大肠杆菌BM Rosetta(DE3)中表达产物。结果:设计多基因表达盒,实现紫杉醇药物生物合成前五步催化酶的单个表达,GGPPS和TS以及THY5α、TAT和TDH的串联表达。结论:利用BglBrick/BioBrick基因组装方法,可以实现紫杉醇生物合成催化酶的快速组装及后续表达。