鼠肝质膜蛋白质组研究的方法评估

细胞质膜是细胞中重要的细胞器, 在肝功能的发挥中具有非常重要的作用. 使用蔗糖密度梯度离心纯化细胞质膜, 通过电子显微镜观察和免疫印迹法检验膜的纯度. 结果显示, 与组织匀浆成分相比, 质膜富集了20倍, 线粒体的污染减少了约50%. 提取的蛋白质用二/一维凝胶电泳(2DE/1DE)分离、胰酶酶解、电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)和基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定, 或者提取的蛋白质直接进行溶液内酶解、液相色谱串联电喷雾离子阱质谱(LC-LTQ)(鸟枪法)鉴定. 一共鉴定了547个非冗余蛋白质, 其中34%为质膜或质膜相关蛋白质. 优化和评估了质膜蛋白质组研究的方法, 且对鼠肝质膜蛋白质组进行了系统的分析.     

大鼠肝再生过程中肝细胞质膜微区差异蛋白质鉴定与分析

动物肝是具有极强再生能力的器官,研究并阐明肝再生的机制可为肝移植等与肝损伤相关的疾病治疗提供理论依据.质膜包括“脂筏(lipid rafts)”和“质膜微囊(caveolae)”的微区,具有参与胞吞胞饮、信号转导、运输胆固醇等重要功能.肝再生过程中,肝质膜微区脂筏蛋白质受到内部调控的影响会发生改变. 捕获脂筏微区信号蛋白分布的变化,对于理解和阐明肝再生过程中信号通路途径有重要意义.本研究应用成熟的大鼠2/3肝切除模型结合蔗糖密度梯度离心法,提取假手术组与肝再生组大鼠肝细胞质膜,并进一步纯化获得质膜微区蛋白质.通过SDS-PAGE分离以及ESI-Q-TOF质谱鉴定,对获得的质膜微区蛋白质进行差异分析. 结果显示,有30个微区蛋白质差异表达,其中13个上调、17个下调.生物信息学分析表明,所鉴定到的蛋白质主要参与细胞增殖、程序性死亡、细胞凋亡等调控,同时涉及到与肝再生密切相关的血管生成等信号通路.本文为质膜微区蛋白质的研究提供了方法上的参考以及相关基础数据,为后续临床肝再生的研究奠定了一定的基础.     

不同分化程度的鼻咽癌细胞系质膜差异蛋白质组分析

本研究以CNE1和CNE2为材料,采用亚细胞蛋白质组研究方法研究不同分化程度鼻咽癌细胞系的差异蛋白质．首先用Percoll密度梯度离心法获得高纯度质膜,通过双向凝胶电泳分离、PDQuest软件分析后找出在肿瘤细胞中表达变化的蛋白质点,再用基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF-MS）进行鉴定,共鉴定到9个具有2倍或2倍以上差异的蛋白质.这些表达差异的蛋白质参与了细胞分化、代谢及细胞信号传导过程．我们对其中5个蛋白质进行了实时定量PCR分析,对其中4个蛋白质的表达进行了免疫印迹验证．本试验为研究不同分化程度的鼻咽癌提供了一种蛋白质组研究方法,并且找到了galectin-1、annexin Ⅱ等一些可能与分化相关的蛋白质.这些数据对于研究鼻咽癌的生物学特性具有非常重要的意义．     

质谱技术解析磷酸化蛋白质组

蛋白质磷酸化是生物体内存在的一种普遍的调节方式,在细胞信号传递中占有极重要的地位.质谱已逐渐被人们认为是挑战这一领域的有利工具.综述了目前利用质谱技术分析磷酸化蛋白质的方法,包括利用固定化的金属亲和层析柱、抗体和化学标签技术富集目的分子,肽片段质量图和前体离子扫描（precusor ion scans）等技术检测磷酸化肽段,串联质谱对磷酸化肽段测序鉴定磷酸化位点,以及引入质量标签对蛋白质的磷酸化水平进行定量等.虽然现在已经有很多可行的方法用于分析磷酸化蛋白质,但要达到从少量生物样品中解析其全部磷酸化蛋白质仍需要有很多技术上的突破.     

免疫性肝纤维化大鼠肝非实质细胞蛋白质组分析

研究肝纤维化发生机制对治疗肝纤维化有重要意义.通过注射猪血清2,4,6和8周后构建纤维化程度S0-1,S2,S3-4及S4期的大鼠肝纤维化模型,采用Masson染色法检测大鼠肝脏的病理学变化.Percoll梯度密度离心富集肝非实质细胞.提取处理4和8周的大鼠肝非实质细胞蛋白,二维凝胶电泳分离,考马斯亮蓝（G250）染色.在第4周样本中鉴定到18个非冗余差异蛋白,通过进一步验证,PDIA3和NDUV蛋白质在蛋白表达水平及mRNA水平具有一致性.大鼠模型Western blot检测及人肝脏免疫组化检测验证PDIA3表达下调.本研究阐明不同时期大鼠肝纤维化模型和正常对照肝非实质细胞蛋白表达变化,揭示了有关肝纤维化进程的重要信息.     

蛋白质组研究技术及其进展

“蛋白质组”（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）由澳大利亚学者Ｗｉｌｋｉｎｓ和Ｗｉｌｉａｍｓ等于１９９４年提出,指的是由基因组编码的全部蛋白质［１］。今后生命科学的重点将是在蛋白质组水平上揭示生命现象的本质及活动规律。尽管蛋白质组概念的提出至今只不过四年时间,但它的...     

2DE-MS中膜蛋白质组的研究进展

2-维凝胶电泳(2DE)具有高分辨率、高通量等特点,已被广泛地用于蛋白质组的研究.然而,2DE-MS在膜蛋白质组学研究方面却有其局限性,主要因为:膜蛋白具有低丰度、难溶、等电点时易沉淀、难酶解等特点.然而随着亚细胞分离技术和直接的生化方法富集等技术的发展,低丰度问题得到了极大的改善;增溶剂(尿素,硫脲),新的两性离子和非离子去垢剂,以及有机溶剂等的利用极大地改善了膜蛋白质组的溶解性能;同时,一些新的2DE技术的利用扩大了常规2DE的分离范围.在膜蛋白裂解方面,将酶解法与化学法(CNBr)相结合,另外先进的质谱技术的发展使得膜蛋白质组的研究在最近几年取得了较大的发展.现对2DE-MS途径中,膜的富集、膜蛋白的提取、分离、酶解、鉴定方面的进展进行综述.     

鸟枪法蛋白质鉴定质量控制方法研究进展

鸟枪法串联质谱蛋白质鉴定策略由于其高可靠和高效率而被广泛应用于蛋白质组学研究中,这种方法直接对蛋白质混合物进行酶切,以肽段为鉴定单元,继而推导真实的样品蛋白质．由于利用质谱图推导肽段存在一定的假阳性率,而且直接对蛋白质混合物的酶切也导致了肽段和蛋白质之间关联信息的丢失,所鉴定的蛋白质难免存在部分不可靠结果．因此,蛋白质鉴定的质量控制在蛋白质组学研究中极为重要．蛋白质鉴定的质量控制包含两大类主要方法,其一为利用肽段进行蛋白质组装,当前最常用也被证明最有效的方法是使用简约原则,即用最少的蛋白质解释所有鉴定肽段,现有的方法可以分为布尔型和概率型,其二为鉴定蛋白质的可靠性评估,包括单个蛋白质鉴定置信度和蛋白质鉴定整体水平的假阳性率计算．综合各种可辅助蛋白质鉴定的先验信息,构建普适的概率统计模型,是目前蛋白质鉴定质量控制方法的发展趋势．     

人类蛋白质组表达谱蛋白质鉴定的分步搜索策略

大规模蛋白质组表达谱研究的蛋白质鉴定一般采取基于数据库搜索的策略,因此数据库的选择及搜索策略在蛋白质鉴定中非常重要。现有的人类蛋白质数据库远不够完善,而从其他物种的蛋白质数据库中所能得到的补充非常有限,但人类基因组数据库中却可能含有很大的补充空间。在对国际人类蛋白质数据库充分调研、比较的基础上,提出了一种分步搜索的策略。这种策略首先利用一个质量较高、覆盖率相对较大的非冗余数据库进行基本鉴定,随后利用其他蛋白和核酸数据库进行补充鉴定和新蛋白挖掘。该策略能有效地鉴定尽可能多的高可靠蛋白,并能进一步充分利用质谱数据进行补充鉴定和新蛋白挖掘,对大规模蛋白质组表达谱研究具有重要的意义。     

适于小麦叶片蛋白质组分析的样品提取方法研究

以‘铭贤169'小麦苗期叶片为材料,分别采用传统的TCA/丙酮沉淀法、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法以及改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取叶片总蛋白,进行双向电泳分离和胶体考染,以建立适用于小麦蛋白质组分析的样品制备方法.结果表明:TCA/丙酮沉淀法较酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法获得的蛋白杂质较少,在二维电泳图谱中的蛋白点较酚抽提-甲醇/醋酸铵沉淀法提取的蛋白点清晰且多.相比于以上2种提取蛋白样品方法,改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取的小麦叶片蛋白杂质少、二维电泳图谱上的点明显增多、分辨率较高.所选小麦的代表性蛋白点能获得成功鉴定.该方法可推广应用于水稻叶片蛋白质组分析的样品提取.     

蛋白质组研究的现状与展望

蛋白质组是后基因组时代出现的一个新兴研究领域。蛋白质组的研究主要是先通过双向凝胶电泳等方法分离蛋白质,然后用质谱等技术进行鉴定。它是后基因组重要的研究方向之一,具有巨大的商业应用前景,将会推动整个生命科学的发展。蛋白质组研究取得了很大进展,已经成为生物技术中的一个重要领域。     

蛋白质组中蛋白质磷酸化研究进展

随着后基因组时代的到来 ,对生命体器官、组织或细胞的全部蛋白质的表达、修饰及相互作用的研究已成为蛋白质组学的重要任务。蛋白质磷酸化是细胞内信号转导和酶调控最常见的机制之一 ,人类基因组约 2 %的基因编码 5 0 0种激酶和 10 0种磷酸酶。蛋白质磷酸化和去磷酸化作为原核和真核细胞表达调控的关键环节 ,了解其对功能的影响可以深入理解生命系统在分子水平的调控状况。目前蛋白质组磷酸化研究仍是功能基因组面临的重大课题 ,本文对此作一综述     

真核细胞质膜蛋白质组研究进展

细胞膜（质膜）蛋白质是细胞的“门铃”与“门户”,是许多药物的作用靶标。细胞质膜蛋白质组的研究正成为蛋白质组研究的热点,这方面的研究有利于具有重要功能的低丰度蛋白质的发掘,为药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而,质膜蛋白质组的研究在强疏水性跨膜蛋白质和低丰度膜蛋白质的分离和鉴定上遇到了方法学的挑战。本文对质膜及其微区的纯化、质膜蛋白质组的分离与鉴定、生物信息学,以及亚细胞定位研究的近期进展作扼要介绍。     

N+注入引起向日葵蛋白质组变异研究初报

低能离子注入可以引起生物DNA分子结构的变异,但用蛋白质组学方法对低能离子注入后所引起的蛋白质诱变效应的研究尚缺乏文献报道。以向日葵种子为实验材料,对N 注入后种子的蛋白质组进行了初步分析,共获得369个蛋白质点,其中包括对照种子中的8个特异点和处理种子中的4个特异点。这些特异点的分子量在15～34ku之间。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定发现对照种子蛋白质中的No.29特异蛋白与MADS盒转录因子HAM59有23．48％的匹配率。处理种子中的No．279特异蛋白与亮氨酸拉链蛋白的同源蛋白HAHB-4有23.20％的匹配率。     

生物传感芯片质谱及其在蛋白质组研究中的应用

目前蛋白质组研究技术在已有的研究基础上取得了长足进展 ,包括固相 ｐＨ梯度双向凝胶电泳、生物质谱技术、蛋白质双向电泳图谱的数字化和各种分析技术、蛋白质间相互作用分析的方法如酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振等。但均各有其利弊。目前质谱是进行蛋白质组成分鉴定的支撑技术 ,但是它在蛋白质间相互作用分析及结构与功能的关系分析方面显得无能为力 ,而生物分子相互作用分析技术 (Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ ,ＢＩＡ)是进行蛋白质相互作用分析的较好技术 ,将两者结合起来在蛋白质组…     

激素型肾阳虚动物肝线粒体蛋白质组与能量代谢相关性

应用凝胶内差异显示电泳技术研究肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组,并从肝线粒体蛋白质组角度阐述肾阳虚与能量代谢的关系.8个分别来自于肾阳虚大鼠和正常大鼠的肝线粒体蛋白质样品(各4个)分别用荧光染料Cy3、Cy5标记,以及8个样品等量混合物用Cy2标记作为内标,每一Cy3、Cy5标记样品与Cy2标记的内标等量混合后在同一胶中进行电泳分离,经不同光激发后扫描得到不同样品的蛋白质组图谱.经DeCyder软件结合内标分析,以肾阳虚组动物与正常组动物肝线粒体蛋白质相差1.2倍以上的蛋白作为差异蛋白,实验共获得16个差异蛋白质,经质谱测定和与蛋白质文库比对,鉴定11个蛋白质.其中,肾阳虚动物热休克蛋白60和70、肌氨酸脱氢酶、氨甲酰磷酸合成酶、亚硫酸盐氧化酶、ATP合酶、醛脱氢酶和NADH脱氢酶表达量增加,而丙酮酸脱氢酶、α酮戊二酸脱氢酶、脂酰辅酶A脱氢酶和鸟氨酸氨基转移酶表达量降低.实验表明,肾阳虚动物能量代谢相关酶的变化与肾阳虚的临床虚寒症状有关.     

小鼠肝质膜蛋白质的生物信息学研究

随着高通量蛋白质组研究技术的发展,使用生物信息学方法对鉴定出的蛋白质进行批量的物理化学性质和功能属性的研究显得越来越重要．对2-DE分离的小鼠肝质膜中鉴定的209个蛋白质运用生物信息学方法进行了一系列的功能属性分析,包括统计分析ProtParam软件计算出的209个蛋白质的理论相对分子质量、等电点以及疏水值的分布情况,使用TMHMM预测蛋白质的跨膜区数目,运用系统发生谱方法预测蛋白质相互作用网络,根据其相互作用网络预测部分未知蛋白质的功能．     

叶绿体蛋白质组研究进展

亚细胞蛋白质组学是近年来蛋白组学研究中的一个热点。通过细胞器的纯化和亚细胞组分的分离,降低了样品的复杂性,增大了相应蛋白质组分的富集,有利于由此分离获得的蛋白质的序列分析及功能鉴定。叶绿体蛋白质组为植物亚细胞蛋白质组学研究中相对全面的一部分,利用亚细胞分离结合双向电泳技术系统地鉴定叶绿体中蛋白质组分是获取叶绿体蛋白质信息、确定其功能的重要技术手段。本文就近年来植物叶绿体蛋白质组涵盖的叶绿体内、外被膜、叶绿体基质、类囊体膜和类囊体腔蛋白的研究进行综述,以全面认识叶绿体蛋白的组成、特点及其在叶绿体生理生化代谢网络中的作用。     

小鼠晶体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究

目的应用双向电泳和质谱技术研究5周龄小鼠晶体蛋白质组。方法提取小鼠晶体总蛋白,进行固相pH梯度（IPG）等电聚焦双向电泳,胶体考马斯亮蓝R-250染色,使用PDQuest7．30图像分析软件分析电泳图像。选择主要蛋白点胶上酶解,应用基质辅助激光解析电离飞行时间／飞行时间（MALDI—TOF／TOF）仪器进行串联质谱（MS／MS）鉴定。结果上样量为882μg和190μg时,分别检测370±41蛋白点（n=3）和57±5个蛋白点（n=3）。高上样量能够较好地分离晶体低丰度蛋白,如念珠状纤维结构蛋白BFSP;低上样量可很好地分离高丰度蛋白-晶体蛋白（包括αA、αB;βA1～βA4;βB1～βB3;γA～γF和γS等）。质谱鉴定得到1种细胞骨架蛋白和16种高丰度晶体蛋白。结论双向电泳和质谱技术有效考察了晶体总蛋白质,为分析白内障形成过程中蛋白质的表达改变提供了新的方法和途径。     

乳腺癌蛋白质组研究进展

乳腺癌是发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤,其发病率占女性恶性肿瘤首位。近年来,蛋白质组研究广泛深入乳腺癌发病机理、临床早期诊断和治疗等各个方面。本文比较系统地综述了乳腺蛋白质组研究的样品处理、研究技术和研究成果。