特定序列DNA检测的几种新方法

特定序列DNA的检测方法通常使用PCR、DNA杂交、连接酶反应等专法。近年来根据不同的啄理又发展出一些新方法,其中比较重要的是基于非酶连接反应、分子信号灯、纳米微粒、以及酶抑制剂-DNA-酶(IDE)的方法。     

两种甲型肝炎病毒抗原快速检测方法的建立

目的建立两种甲型肝炎病毒抗原(HAV-Ag)检测试剂盒,并对其检测效果进行评价。方法生物素标记甲型肝炎病毒抗体(HAV-Ab)与辣根过氧化物酶标记亲和素联合应用建立甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法;同时使用辣根过氧化物酶标记HAV-Ab作放大系统建立双抗体夹心甲型肝炎病毒抗原ELISA检测试剂,对比两种检测方法的特异性、灵敏度及实际应用效果。结果用生物素标记甲型肝炎病毒抗体-辣根过氧化物酶标记亲和素作放大系统建立的甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法,较双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度高1～2个稀释度;两种检测法均对10余种病毒无交叉,P/N值BA-ELISA检测法较高。结论甲型肝炎病毒抗原BA-ELISA检测法是一种灵敏度高,特异性好,方便快捷的检测方法,可广泛应用于甲型肝炎病毒研究及临床检测中。而甲型肝炎病毒抗原双抗体夹心ELISA检测法,检测灵敏度适中,操作简单,更适用于甲肝疫苗生产检定。     

牛疱疹病毒Ⅳ型(DN-599株)DNA的限制性酶切位点图及重复序列分析

牛疱疹病毒Ⅳ型(BHV-4)DNA片段分别被重组到质粒pUC9或pBR322的EcoRI、Hind Ⅲ和BamHⅠ位点中,用光生物素(Photobiotin)标记这些重组质粒作为探针,分别与转移到硝基纤维素膜上的病毒DNA的EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ片段进行杂交,根据杂交结果及克隆的BHV-4DNA片段的双酶切分析,画出了病毒DNA的EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ位点图,井证明在病毒DNA的两末端含有多聚重复序列,左侧含12个重复单位,右侧含6个重复单位,两侧重复单位的排列方向相同,重复单位的大小为2.35kb。病毒DNA分子无任何异构体.     

庚型肝炎病毒5‘端非编码区cDNA的序列分析

为了解国CBV-C/HCV株的基因序列与国外分离株的同源性状况,对我国GBV-C/HCV的5’端非编码区（5’NCR）。cDNA进行了序列测定。参考国外发表的序列资料,在相对保守的5’NCR设计两对HGV特异性引物。采用热变性法提取云南省一个静脉吸毒者血浆中的GBV－C／HGVRNA逆转录为cDNA后进行巢式聚合酶链反应（PCR）扩增,获得238bp的片段。PCR产物纯化后直接经双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。与国外分离株比较,同源性为86.36％～90.9t％,微分区域变异较大。结果表明,所扩增片段属于GBV－C／HGV基因,所测序列可为引物设计据供依据。对核酸变异性分析有一定意义。     

基于序列非依赖性扩增技术发现未知病毒的研究进展

随着第二代测序技术的发展,组学技术在微生物学领域的运用变得广泛,其中病毒宏基因组学技术在发现未知病毒和病毒检测方面发挥了越来越重要的作用。序列非依赖性扩增是病毒宏基因组学研究中最关键的一步,它直接影响目的序列的获得及后续实验的展开。本文主要介绍和归纳了几种常用的序列非依赖性扩增技术在病毒宏基因组学中的应用,比较、分析了几种序列非赖依性扩增的差别和优缺点,为读者使用此技术提供参考。     

基于DNA序列K-tuple分布的一种非序列比对分析

文章在基因组K-tuple分布的基础上, 给出了一种推测生物序列差异大小的非序列比对方法。该方法可用于衡量真实DNA序列和随机重排序列在K-tuple分布上的差异。将此方法用于构建含有26种胎盘哺乳动物线粒体全基因组的系统树时, 随着K的增大, 系统树的分类效果与生物学一致公认的结果愈加匹配。结果表明, 用此方法构建的系统进化树比用其他非序列比对分析方法构建的更加合理。     

酪胺信号放大-量子点标记银染增强的基因芯片可视化检测方法的建立

目的:建立一种酪胺信号放大-量子点标记银染增强的基因芯片可视化检测方法,提高基因芯片检测的灵敏度。方法:待测靶基因与固定在玻片上的探针杂交,依次加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、生物素标记的酪胺及链霉亲和素标记的量子点,37℃孵育,然后加入银增强试剂显色,最后用可视化生物芯片扫描仪扫描并记录结果;以牛布鲁菌210105株为检测对象,以酪胺信号放大-荧光素Cy3(TSA-Cy3)检测法为对照方法,测定酪胺信号放大-量子点标记银染增强(TSA-QDS)检测法的灵敏度。结果:确定了基因芯片量子点标记银染增强可视化检测方法的检测流程,优化了检测条件,并考察了检测灵敏度。优化的检测条件为:酪胺-生物素稀释比例为1∶4000,链酶亲和素标记的量子点稀释比例为1∶50,37℃孵育时间为25~30 min,银染增强时间为6~7 min。检测牛布鲁菌的灵敏度为103CFU/mL。结论:该方法实现了基因芯片高灵敏度可视化检测,其灵敏度与荧光法相当,并且有可视化的优势。     

我国非肠道传播非甲非乙型肝炎(丙型)病毒NS3蛋白的部份cDNA克隆及序列分析

用15ml非肠道传播非甲非乙型肝炎病人的混合血清提取病毒RNA,经逆转录和聚合酶链反应(PCR)扩增,获得583个核苷酸的非肠道传播非甲非乙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白的cDNA片段.该片段与美国报道的同片段HCV cDNA原型比较,核酸序列同源性为80.9％,氨基酸序列同源性为93.2％。与日本报道的同片段J1 HCV cDNA相比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为92.6％和95.2％。用α-~(32)P同位素标记该片段,与HCV病人血清出现杂交反应。     

中国甜菜坏死黄脉病毒RNA5的检测及其核苷酸序列分析

利用反转录 Ｐ Ｃ Ｒ 方法,对甜菜坏死黄脉病毒（ Ｂ Ｎ Ｙ Ｖ Ｖ）５ 个中国分离物的 Ｒ Ｎ Ａ５进行了检测,结果表明新疆分离物、黑龙江分离物和内蒙古乌拉特前旗分离物不含有 Ｒ Ｎ Ａ５ ,只有包头分离物和呼和浩特分离物有 Ｒ Ｎ Ａ５ 。序列分析结果,包头分离物和呼和浩特分离物 Ｒ Ｎ Ａ５ 基因组分别为１３３８ ｎｔ 和１３５８ ｎｔ,均只包含１ 个开放阅读框架,编码产生２６ ｋ Ｄ 蛋白。与法国 Ｆ７２ 分离物和日本 Ｄ５ 分离物相比, 各分离物间核苷酸序列同源性为９３７ ％ ～９８５ ％ ,由此推导的氨基酸序列同源性为９１８ ％ ～９８２ ％ 。     

土拨鼠肝炎病毒表面抗原基因的位置,核苷酸序列及其与人的乙型肝炎病毒表面抗原基因的比较

结果部分(摘登) 开始DNA序列分析的时候,首先要用几种最有效的限制性内切酶消化Eco WHV DHA~+,并用2％琼脂糖凝胶电泳把这些DNA片段分开。如图Ⅰ(从略见原文)所示:HaeⅢ和HinfⅠ消化的Eco WHV DNA。给出了一系列体积大小不同盼DNA片段,其中各有一个片段大于1000个碱基。用HaeⅢ和HinfⅠ混合消化时,这些大片段消失了。这     

侵染白术的蚕豆萎蔫病毒2号的分子检测与序列分析

为鉴定引起山西绛县白术花叶、黄化等症状的病原,利用生物学接种、非序列依赖性PCR扩增(SIA)和RTPCR的研究方法,对白术病样进行了研究,结果表明:接种感病白术病汁液的指示植物昆诺藜表现退绿枯斑,经单斑分离后转接健康白术植株呈现出与病样类似的症状,初步证明白术病害可能为病毒引起的;SIA检测表明感病白术为蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)侵染所致;为明确BBWV2白术分离物(BBWV2-Am)的分类地位,进一步克隆了BBWV2-Am RNA2外壳蛋白大亚基基因(LCP)和外壳蛋白小亚基基因(SCP)序列;序列同源性分析表明,LCP基因和SCP基因与已发表的BBWV2其它株系相应基因核苷酸序列的同源性分别为79.3%~87.2%和80.1%~89.2%,氨基酸序列同源性分别为91.2%~95.7%和89.4%~95.5%;系统进化树分析显示,BBWV2-Am与BBWV2地黄分离物(BBWV2-Rg)形成一个独立分支,二者亲缘关系最近。这是BBWV2侵染白术的首次报道。     

识别序列为非回纹对称结构限制核酸酶的正确切割位点

限制性内切核酸酶的切割识别序列分为回纹对称和非回纹对称结构两类,由于DNA是互补双链, 所以对于识别序列为回纹对称结构的限制酶,其识别序列在DNA的两条链上是一致的, 可以写为一个, 但对于识别序列为非回纹对称结构的限制酶来说,其识别序列应为两个,而一些工具书、参考书中仅写为一个。本文通过一个酶切实验证明其识别序列为两个。同时希望通过本文,敦促一些工具书、参考书更正其错误。 Abstract:The recognizing sequence of restriction enzyme includes palindrome and nonpalindromic,and DNA is double helix complementary strands.So the recognizing sequences of palindrome enzyme in two strands of DNA were identical,and can be considered of one sequence.But for nonpalindromic restriction enzyme,the recognizing sequences of two strands of DNA were not identical.Therefore the true recognizing sequences are not only one.In this experiment,an enzyme cleavage reaction was carried out which confirmed that the true recognizing sites/sequences of nonpalindromic enzyme are two instead of one.     

不需要放射性同位素的糖基化DNA探针

在为获得安全、快速、非放射性的DNA标记方法的探索中,我们已研制出用于产生和检测糖基化DNA的程序。此项工作始于葡糖基化DNA(来自T4噬菌体)可被伴刀豆球蛋白(ConA).沉淀这一观察。一种葡萄糖取代的三磷酸胸苷类似物(2′-脱氧尿苷-5-烯丙基胺-麦芽三糖一5′-三磷酸盐)已被合成,并在缺口翻译反应中用于标记DNA。掺入的速度和程度均类似于被代替的三磷酸胸苷。     

中国甜菜坏死黄脉病毒RNA5的检测及其核苷酸序列分析*

利用反转录PCR方法,对甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)5个中国分离物的RNA5进行了检测,结果表明新疆分离物、黑龙江分离物和内蒙古乌拉特前旗分离物不含有RNA5,只有包头分离物和呼和浩特分离物有RNA5。序列分析结果,包头分离物和呼和浩特分离物RNA5基因组分别为1338nt和1358nt,均只包含1个开放阅读框架,编码产生26kD蛋白。与法国F72分离物和日本D5分离物相比,各分离物间核苷酸序列同源性为93.7%～98.5%,由此推导的氨基酸序列同源性为91.8%～98.2%。     

我国分离的盖塔病毒衣壳蛋白基因和3′非翻译区分子特征研究

对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒(GETV)(M1、HB0215-3和HB0234)进行衣壳蛋白基因和3′UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征。首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3′UTR片段,纯化后连接到载体中进行测序,然后用Clastal X和DNASTAR软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA软件绘制系统发生树。3株病毒衣壳蛋白基因分别由801、804和804个核苷酸组成,分别编码267、268和268个氨基酸,3株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性为97.6%~100%和97.8%~100%,与其他GETV分离株核苷酸同源性在95.4%~99.6%之间。3株病毒3′UTR分别由411、401和401个核苷酸组成,发现中国株存在10个(45~54位)核苷酸缺失和2个(64位、148位)特有的核苷酸位点。进化分析表明盖塔病毒之间的进化关系与分离年代相关,中国境内流行的盖塔病毒是相对独立的一个类群。     

我国分离的盖塔病毒衣壳蛋白基因和3'非翻译区分子特征研究

对我国海南省和河北省分离到的3株盖塔病毒(GETV)(M1、HB0215-3和HB0234)进行衣壳蛋白基因和3'UTR区序列测定,并分析比较该病毒的分子生物学遗传特征.首先应用逆转录聚合酶链反应扩增出病毒衣壳蛋白基因和3'UTR片段,纯化后连接到载体中进行测序,然后用Clastal X和DNASTAR软件对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,用MEGA软件绘制系统发生树.3株病毒衣壳蛋白基因分别由801、804和804个核苷酸组成,分别编码267、268和268个氨基酸,3株病毒之间核苷酸和氨基酸序列同源性为97.6%～100%和97.8%～100%,与其他GETV分离株核苷酸同源性在95.4%～99.6%之间.3株病毒3'UTR分别由411、401和401个核苷酸组成,发现中国株存在10个(45～54位)核苷酸缺失和2个(64位、148位)特有的核苷酸位点.进化分析表明盖塔病毒之间的进化关系与分离年代相关,中国境内流行的盖塔病毒是相对独立的一个类群.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测

[目的]口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测.[方法]利用原核表达系统表达了FMDV NSP 3A、3B和富含B细胞抗原位点序列的2C蛋白.利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对2C蛋白进行复性.用金属鳌合亲合层析的方法对表达的FMDV NSP 3A、3B和2C进行纯化.采用ELISA方法对比检测了3种纯化蛋白在检测羊血清NSP抗体的效果.[结果]检测得知3A和3B为可溶性表达蛋白,2C以包涵体形式表达.通过Western-blot分析,表明纯化后蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.纯化的3A、3B和复性后的2C融合蛋白与3ABC抗原的检测结果具有很高的符合性.[结论]该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫电转移印迹技术(EITB)提供了所需的材料.