丹参诱导鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞优化方案及电生理研究

分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs), 采用丹参对4～5代MSCs进行反复多次诱导分化及再分化, 将其诱导分化为神经样细胞, 倒置显微镜下连续观察形态学变化, 通过免疫荧光细胞化学检测神经样细胞巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白 (neurofiliament, NF)、突触(小)泡蛋白(synaptophysin) 的表达, 采用细胞膜电位特异的荧光探针DiBAC4(3)标记细胞, 激光扫描共聚焦显微镜动态监测细胞受高钾刺激前后的荧光强度变化, 观察细胞电生理反应.结果显示: MSCs第1次经过丹参诱导2 h后, MSCs伸出突起, 向神经性细胞形态转变, 此时巢蛋白表达率为 (95.1±2.1)% (x±s, n=3), 基本不表达NF; 随着诱导分化及去分化过程的次数增加, 细胞分化为神经样细胞的时间缩短, 突起拉长并交互缠绕呈复杂网状, MSCs第4次经过丹参诱导1 h后, NF表达率(95.3±1.6)% (x±s, n=3), 并表达突触(小)泡蛋白, 5 h后突触(小)泡蛋白表达更为广泛; 激光共聚焦扫描显微镜显示第4次诱导5 h后的细胞在高钾刺激下发生去极化, 胞内荧光强度瞬时增强, 而MSCs空白对照对高钾刺激无反应.本优化诱导方案可以高效率地诱导MSCs分化为具有电生理特性的神经样细胞.     

基于pH值敏感的荧光染料分析腺病毒诱导T淋巴细胞胞内体膜的裂解北大核心CSCD

【目的】探索基于pH值敏感的荧光染料分析腺病毒裂解T淋巴细胞胞内体膜的实验方法。【方法】本文以Jurkat细胞(T淋巴瘤细胞)为靶细胞,将pH值敏感的荧光染料pHrodo dextran与5型腺病毒(Ad5)共同孵育Jurkat细胞,对pHrodo dextran孵育的浓度与时间进行了优化,利用激光共聚焦显微镜分析胞内相对平均荧光强度百分比随时间的变化情况,反映Ad5诱导胞内体膜裂解情况。【结果】研究结果表明,在pHrodo dextran终浓度为80μg/m L,孵育时间为10 min条件下,在病毒感染后的30 min,相对平均荧光强度百分比出现显著下降;利用巴佛洛酶素A1抑制胞内体膜质子泵活性后,相对平均荧光强度百分比出现轻微下降。【结论】建立了基于pHrodo dextran分析腺病毒诱导T细胞胞内体膜裂解的新方法。     

印楝素A与印楝素B对粉纹夜蛾BTI-Tn-5B1-4的细胞毒性

为了明确印楝素A和B活性差异的机理,本研究比较了印楝素A和印楝素B对粉纹夜蛾Trichoplusia ni离体培养胚胎细胞系BTI-Tn-5B1-4的毒性。结果表明：印楝素A与印楝素B对BTI-Tn-5B1-4细胞具有良好的增殖抑制活性,处理后3 d,其IC₅₀值分别为2.9 μg/mL和9.85 μg/mL,印楝素A的细胞毒力显著高于印楝素B。倒置显微镜观察发现,印楝素A和印楝素B处理可导致细胞变形,贴壁能力下降,并出现明显空泡,印楝素A的影响明显高于印楝素B。流式细胞仪检测结果表明,印楝素可导致BTI-Tn-5B1-4细胞体积显著膨大,印楝素A处理细胞体积增大程度显著高于印楝素B;印楝素可以明显影响BTI-Tn-5B1-4细胞膜电位,1.25 μg/mL印楝素A和印楝素B处理后3 d,细胞DiBAC4（3）荧光强度分别增加88.12%和55.37%,印楝素A的影响显著高于印楝素B。荧光显微镜观察发现,印楝素对BTI-Tn-5B1-4细胞核具有明显影响,印楝素B的影响明显高于印楝素A,印楝素B处理后,细胞核受损细胞数更多,受损程度更严重。结果显示印楝素A和印楝素B的细胞作用机理存在差异,本研究从细胞学水平解释了印楝素的生长发育抑制作用机理。     

用DAPI染色法观察红鲫胚胎发育

以红鲫为研究材料,采用DAPI荧光染料对脱膜的红鲫胚胎进行染色,在荧光体视显微镜下观察红鲫胚胎早期卵裂到囊胚发育的过程.结果表明,该染色方法操作便捷,能更清晰的观察到胚胎发育的外形.值得一提的是:该方法较光学显微镜观察能清晰的观察到核DNA在细胞中的定位,如囊胚期能观察到早期卵裂细胞正进行频繁的有丝分裂等.该方法的获得...     

斑蝥素对草地贪夜蛾Sf9细胞膜完整性和膜电位的影响

为明确斑蝥素对昆虫细胞膜的作用及其机理, 本研究利用草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的卵巢细胞系Sf9细胞作为实验材料, 采用透射电子显微技术(transmission electron microscope , TEM)、 激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)结合荧光探针FDA/PI及DiBAC4(3)技术研究斑蝥素(cantharidin, CTD)对Sf9细胞膜完整性及膜电位（membrane potential, MP）的影响。结果表明： 32 μmol/L CTD处理6 h和12 h后, 电镜观察均未发现细胞膜结构破损; FDA/PI染色后, 32 μmol/L CTD处理0.5 h后细胞FDA荧光强度比对照显著降低(P<0.05), 碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色的细胞比例与对照无显著性差异(P≥0.05)。32 μmol/L CTD处理140 s后即引起MP发生显著性去极化(P<0.05); 64 μmol/L CTD处理瞬时MP发生显著性去极化(P<0.05); 32 μmol/L CTD处理3 h内及64 μmol/L CTD处理2 h 内MP仍保持显著性去极化(P<0.05), 之后去极化程度降低; 32 μmol/L CTD处理6 h及64 μmol/L CTD处理3 h时MP去极化与对照组相比已无显著性差异(P≥0.05)。结果说明, CTD处理短时间内可引起Sf9细胞膜电位去极化并维持一段时间, 同时导致细胞活性发生不可逆下降, 但未对细胞膜结构完整性产生破坏。     

一种基于荧光强度分析的高通量定量检测细胞凋亡方法

根据正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜对核酸荧光染料的不同选择通透性,用4μmol/L YO-PRO-1（YP）和4μg/ml 碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色96孔板中的细胞样品。分别在485/538 (Ex/Em, nm) 和530/590 (Ex/Em, nm) 的检测波长下借助荧光分光光度计检测细胞样品孔的YP和PI荧光强度。将YP和PI荧光强度值与用荧光显微镜对同一细胞样品细胞凋亡和坏死的定量分析结果相对应,通过对YP荧光强度值与凋亡细胞数的直线回归分析 (r = 0.999,P<0.01),得到依据YP荧光强度值求得凋亡细胞数的直线相关方程。该方法可检测出样品中少至180个的凋亡细胞,具有灵敏度高和快速高效的特点。     

基于CFTR的胞浆内第二信使cAMP检测方法的建立*

目的: 建立一种基于CFTR可敏感检测胞浆内第二信使cAMP的检测方法。方法: 构建CFTR和YFP-H148Q/I152L真核表达载体,应用脂质体转染法构建共表达CFTR和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞,倒置荧光显微镜观察其表达情况,流式细胞仪检测细胞纯度;荧光淬灭动力学实验验证细胞模型的有效性;荧光淬灭动力学实验验证细胞模型可筛选CFTR调节剂;放射免疫法检测加入CFTR激活剂后细胞内的cAMP浓度。结果: 倒置荧光显微镜下观察到CFTR表达在细胞膜上,YFP-H148Q/I152L表达于胞浆中;成功构建共表达CFTR和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型;荧光变化斜率值与CFTR调节剂浓度成剂量依赖关系,该模型可筛选CFTR调节剂;荧光变化斜率值可反映胞浆内cAMP浓度,该模型可敏感检测胞浆内cAMP浓度。结论: 此细胞模型可以高效敏感检测胞浆内第二信使cAMP浓度,为cAMP信号相关靶点的研究提供一种简便快捷的方法。     

光学方法同步记录成群前庭神经节细胞膜电位

目的 :采用电压敏感染料和多位点光学成像系统研究前庭神经节细胞 (vestibularganglioncells ,VGCs)电生理特性。方法 :自新生小鼠内耳分离并培养的VGCs ,用吸光性电压敏感染料RH15 5染色后 ,多个或成群VGCs被同时成像于 16× 16记录单元Photodiodearrays (PDA)光学成像系统。 结果 :用高钾溶液灌流刺激时发现当VGCs膜电位变化时 ,膜表面的光吸收增强 ,光吸收度为 0 .2 3%± 0 .0 8%。并且所记录的光学反应具有波长特性。另外 ,在本实验条件下 ,光损伤和染料的药毒性副作用不明显或者可忽略不计。结论 :光学记录可以同步观测多个和成群VGCs膜电位变化 ,是电生理研究的新方法     

利用斑马鱼胚胎快速鉴定真核质粒中目的基因表达的研究

目的建立利用斑马鱼胚胎快速鉴定真核质粒中目的基因表达的实验体系。方法选20枚斑马鱼受精卵,在显微镜下每隔1h记录胚胎的发育情况。另选250枚单细胞期斑马鱼胚胎,平均分成5组,一组胚胎作为对照,剩余4组分别向胚胎的单细胞内注射pEGFP-N1(真核表达质粒)、pCMV-DsRed-Express2(真核表达质粒)、pET28-GFP(原核表达质粒)、pET28-RFP(原核表达质粒)质粒,在不同时间点连续观察绿色荧光及红色荧光的表达情况。另选600枚单细胞期斑马鱼胚胎,平均分成3组,一组胚胎作为对照,一组向胚胎单细胞内注射pEGFP-N1质粒,另外一组向胚胎单细胞内注射pEGFP-N1-MUC1外源基因融合重组质粒,注射4h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况,并用RT-PCR的方法检测目的基因MUC1mRNA的转录情况。结果注射pEGFP-N1、pCMV-DsRed-Express2真核表达质粒的胚胎,注射4h后分别观察到很强的绿色荧光及红色荧光;注射pET28-GFP、pET28-RFP原核表达质粒的胚胎,10h内都未观察到绿色荧光及红色荧光;注射pEGFP-N1-MUC1外源基因融合质粒,注射4h后同样...     

两种人胃癌细胞M期与间期时相质膜表面Con A受体复合物分布及侧向运动

利用荧光标记和荧光漂白恢复方法研究了两种人胃腺癌细胞M期与间期时梠中,细胞膜表面ConA受体复合物分子的分布与侧向运动.结果表明:MGC80-3细胞M期时相与SGC7901细胞间期时相膜表面ConA受体复合物分布近似,其侧向运动方式呈扩散型;SGC 7901 M期时相细胞膜表面ConA受体复合物的分布与MGC80-3细胞间期时和相基本类似,其侧向运动主要是流动型.凡是受体复合物是流动型运动的细胞.其膜上可动分子的百分比都寓于扩散型运为的细胞,P值小于0.01.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Photoregulation of seed germination of wild-type and of an aurea-mutant of tomato

Seed germination of an aurea mutant of tomato ( Lycopersicon esculentum Mill.) is promoted by continuous irradiation with red, far-red or long-wavelength far-red (758 nm) light as well as by cyclic irradiations (5 min red or 5 min far-red/25 min darkness). Far-red light applied immediately after each red does not change the germination behaviour. Seed germination of the isogenic wild-type, cv. UC-105, is promoted by continuous and cyclic red light while it is inhibited by continuous and cyclic far-red light and by continious 758 nm irradiation. Far-red irradiation reverses almost completely the promoting effect of red light. The promoting effect (in the aurea mutant) and the inhibitory effect (in the wild-type) of continuous far-red light do not show photon fluence rate dependency above 20 nmol m⁻² s⁻¹. It is concluded that phytochrome controls tomato seed germination throgh low energy responses in both the wild type and the au mutant. The promoting effect of continuous and cyclic far-red light in the au mutant can be attributed to a greater sensitivity to P_fr.     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。