犏牛FSHβ基因的5'端侧翼区的序列测定和比较研究

目的:为探求犏牛FSHβ基因的5’端侧翼区的序列特征,揭示该基因的变异和对家畜产仔率的意义,方法:根据奶牛FSHβ基因的5’端侧翼区的基因序列设计引物,应用PCR方法扩增并克隆了犏牛FSHβ基因的5’端侧翼区的序列,扩增序列长度为2022bp,包括5’端上游调控序列、第一外显子和部分第一内含子,并与奶牛该区段序列进行了比较研究。结果:序列分析结果表明:犏牛FSHβ基因的5’端侧翼区与文献报道的奶牛该基因的同源性为98.37%。结论:这为研究杂交一代犏牛雄性雄性不育,为开展牦牛功能基因组计划和分子育种提供了一定的科学的理论依据。     

麦洼牦牛和九龙牦牛FSHβ基因的PCR-SSCP分析

运用一对特异性引物对麦洼牦牛、九龙牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区进行了扩增,应用PCR-SSCP方法对其进行了多态性分析。结果表明:在麦洼牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区有AA型、AB型和BB型三种基因型,九龙牦牛的FSHβ基因的5’端侧翼区只检测到了AA型、AB型两种基因型。在两种牦牛品系中,AA基因型频率最高,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。麦洼牦牛和九龙牦牛群体中多态信息含量分别为0.3431、0.1411,麦洼牦牛多态性能高,遗传变异大。     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及其调控外源基因表达的研究

目的制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列,并验证其指导外源基因表达的能力.方法用PCR法从奶牛染色体上分5段扩增出了全长8.2Kb的牛β-乳球蛋白基因,包括1.8Kb的5′侧翼区、1.7Kb的3′侧翼区及4.7Kb的gDNA区.扩增出的各片段克隆到T-载体上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性.将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达.结果注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性.结论所克隆的牛β-乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达.     

水稻种子醇溶蛋白4a基因的表达受串联复合启动子调控

从水稻中花8号中克隆了醇溶蛋白4a的基因5＇侧翼区并首次报道该基因5＇端-680～-18区段具有胚乳特异性表达调控功能.本研究通过 5’缺失方法对该基因5＇侧翼区的结构和功能进行了进一步分析,结果表明:(1)醇溶蛋白4a基因启动子Ⅰ能够特定地在转基因烟草开花发育 22 d后的种子胚乳中激活下游 GUS融合基因表达,是该基因有功能的启动子;(2)prolamin box Ⅱ对该基因的表达具有增强功能;(3)启动子Ⅰ的转录起始点是位于该基因起始ATG上游63 bp处的C碱基.     

团头鲂促性腺激素GtH Iβ亚基基因5'端启动子区克隆及表达载体构建

本研究利用改进的锚定PCR方法克隆了团头鲂（Megalobrama amblycephala）促性腺激素IB（GtHIβ）亚基基因5＇端侧翼序列,并在生物信息学方法分析的基础上构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示：克隆得到的GtHIβ亚基基因5’端侧翼序列长度为479bp,其中包括TATA盒、ARE、PRE、ERE、SF-1、Ptxl等可能对GtHIp亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法在基因组中扩增得到了3个缺失片段,并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂GtHIp亚基基因5’端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。     

鸡8个功能基因5'-侧翼区与内含子的 SNP多样性比较

本研究旨在探讨鸡功能基因5'-侧翼区的单核苷酸多态性(SNP)水平.作者以自来航鸡、隐性白洛克鸡、杏花鸡、丝羽乌骨鸡、固始鸡、红色原鸡为材料,扩增了GH、DDBC1、RIKEN、RASGRP3、IGF1、THRSP、VIP及PRL共8个基因的5'-侧翼区DNA序列.扩增序列全长为8,399 bp,SNP的总数为161个,平均每52 bp出现一个SNP.8个功能基因5'-侧翼区核苷酸多样性的θ均值和π均值分别为0.00620±0.00110和0.00559±0.00100.比较检验表明,5'-侧翼区的SNP多样性显著低于内含子区域.5'-侧翼区是基因表达的一个重要调控区域,在分子进化和系统发生过程中承受着比内含子区域更大的选择压,其较低的SNP多样性是适应性较好的表现.Tajima检验与Fu和Li检验表明,与鸡繁殖性状显著关联的VIP基因和PRL基因很可能是人工选择或自然选择的目的基因.     

牦牛BLG基因5'调控成分的克隆及序列分析

目的:克隆牦牛β-乳球蛋白(BLG)基因5'调控成分(3.5kb).方法:利用PCR方法克隆了牦牛BLG基因5'侧翼区,并进行生物信息学分析表明.结论:获得了3.5kb的BLG基因5'调控成分,其中包括5'侧翼区(2 472bp),第一外显子及第一内含子(1 066bp).该序列与牛、绵羊和山羊的同源性分别为98.42%、89.61%和84.41%;平均GC含量为49.3%;存在一个CpG岛;可能存在一个启动子位点,位于起始密码子前-83bp处;AliBaba2.1分析发现该区域有47种潜在的转录因子结合位点,其中包括乳蛋白结合因子(MPBF)、乳腺活化因子(MAF)、糖皮质激素受体(GR)、雌激素受体(ER)、核因子1(NF-1)等结合位点,提示该调控成分可用于构建乳腺特异性表达载体.结果:成功克隆出BLG基因5'侧翼区,为构建转基因牦牛乳腺生物反应器的特异性表达载体奠定基础.     

黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因片段进化分析

目的:揭示黄牛、牦牛和犏牛与其他物种的系统发育关系。方法:通过PCR扩增和克隆测序获得黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Boule基因片段序列,并运用生物信息学软件与NCBI已报道的其他17个物种Boule基因编码区片段序列比对分析。结果:黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Boule基因RT-PCR扩增特异性条带为154bp,与引物设计源序列进行同源性比较,发现同源性达99%,系统发育树显示,牛科中的牦牛、犏牛和黄牛交错聚在一起(BP=99%),然后与哺乳纲的其他物种相聚,而犏牛与爬行纲和鸟纲动物的亲缘关系较远。结论:Boule基因在动物体上同源性高,可应用于系统发生研究。     

赤拟谷盗β1-微管蛋白cDNA基因的克隆及序列分析

本研究利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和快速扩增cDNA末端（RACE）技术对赤拟谷盗Tribolium costaneum体内β1-微管蛋白（β1-tubulin）基因进行了克隆,获得的基因（EU555191）全长为1573bp,包含1344bp的完整开放阅读框（ORF）。根据该基因推导出447个氨基酸序列,理论分子量约为50KD,等电点为4．68,该序列含有2个氨基酸保守区：NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEMEFTE,并且在该基因的5’端启动子调控区发现TATA-box保守基因序列。系统发育关系研究表明：本研究扩增出的基因与其它昆虫β-tubulin基因序列有较高的同源性,达90％左右。     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5＇NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

结构域Ⅰ缺失的丙型肝炎病毒5'NCR调控荧光素酶基因的表达

目的：分析丙型肝炎病毒（HCV）5＇端非编码区（NCR）的结构域Ⅰ序列在其翻译启动活性中的作用.方法：以质粒pCMVNCRluc为模板,PCR扩增分别得到缺失5＇端20nt和43nt的HCV 5＇NCR片段,并分别替换pCMVNCRluc中的完整HCV 5NCR,构建结构域Ⅰ缺失的HCV 5＇NCR调控萤火虫荧光素酶（luc）基因表达的真核表达质粒（pCNl-d1、pCNl-d2）.以脂质体方法转染人肝癌细胞株HepG2,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对于内参考的海肾荧光素酶表达活性,同时采用RT-PCR方法检测转染后细胞中萤火虫荧光素酶基因的相对表达水平.结果：酶切和测序结果表明,各重组质粒构建成功.各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCMVNCRluc相比差异无显著性（P＞0.05）;pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCMVNCRluc差异无显著性（P＞0.05）.结论：HCV 5NCR的5＇端20nt和43nt序列缺失不影响它的翻译启动活性.     

猪FSH β亚基基因结构区Alu序列插入突变的研究

通过聚合酶链式反应（PCR）对中国华北型优良地方猪种莱芜猪及杜里猪,长白猪的卵泡刺激素（FSH）β亚基基因结构区插入片段进行扩增,并对0．5kb扩增产物进行克隆和测序,序列分析表明,在已发表的猪FSHβ亚基基因全序列的＋809和＋810碱基之间,莱芜猪,杜里猪和长白猪分别存在一个长度为275,277和274bp的插入片段,插入片段末端的poly(A)分别为17,19和16个腺苷酸,均显著短于高产猪种太湖猪（292bp和32个腺苷酸）,对FSHβ亚基基因插入片段进行BamHI多态性分析,发现本研究所检测样品中不存在BamHI 多态性,插入片段中存在一个RNA聚合酶Ⅲ启动子及AluI内切酶识别位点,所以该睡段可能为Alu成分,因RNA聚合酶Ⅲ这种有功能的内部启动子能够转录相邻的染色体序列,该插入片段可能影响FSHβ亚基基因或其他基因的表达调控,把FSHβ亚基基因作为控制猪产仔数主效基因的候选基因与产仔数进行连锁分析,证明FSHβ基因因座在莱芜猪种中与控制猪产仔数的主效基因紧密连锁,优质基因AA纯合子比BB纯合子母猪平均每胎产仔1．2头,因不同品种猪插入序列的主要差异是末端的poly(A)长短不同,推测该插入片段末端的pol(A)结构亦可能影响猪的产仔数。     

抗HFRSV人单抗可变区基因克隆及其序列测定

从杂交瘤细胞株87—2提取细胞总RNA．反转录合成cDNA链,进行PCR反应。其中扩增重链可变区一对引物分别与人免疫球蛋白重链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补;扩增人λ轻链可变区引物与人免疫球蛋白λ轻链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补。将重、轻链可变区基因的PCR扩增产物分别插入M13噬菌体．经转化筛选分别获得重组克隆。双脱氧法测定其序列,所得核苷酸序列经计算机分析,轻、重链可变区基因长度分别为309bp和405pb,编码103个氨基酸和135个氨基酸,有明显抗体可变区特征,具有骨架区和抗原互补区。     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

鸡8个功能基因5′-侧翼区与内含子的SNP多样性比较

本研究旨在探讨鸡功能基因5′-侧翼区的单核苷酸多态性(SNP)水平。作者以白来航鸡、隐性白洛克鸡、杏花鸡、丝羽乌骨鸡、固始鸡、红色原鸡为材料,扩增了GH、DDBC1、RIKEN、RASGRP3、IGF1、THRSP、VIP及PRL共8个基因的5′-侧翼区DNA序列。扩增序列全长为8,399bp,SNP的总数为161个,平均每52bp出现一个SNP。8个功能基因5′-侧翼区核苷酸多样性的θ均值和π均值分别为0.00620±0.00110和0.00559±0.00100。比较检验表明,5′-侧翼区的SNP多样性显著低于内含子区域。5′-侧翼区是基因表达的一个重要调控区域,在分子进化和系统发生过程中承受着比内含子区域更大的选择压,其较低的SNP多样性是适应性较好的表现。Tajima检验与Fu和Li检验表明,与鸡繁殖性状显著关联的VIP基因和PRL基因很可能是人工选择或自然选择的目的基因。     

Cloning of IGF2b 5'Flanking Region and Methylation Analysis of Its GC-rich Sequence in Common Carp (Cyprinus carpio)

鲤(Cyprinus carpio)胰岛素样生长因子2b(insulin-like growth factor 2b,IGF2b)基因为鲤IGF基因家族重要的成员,已有的研究表明5’侧翼区序列对其功能的发挥有重要作用.因此,采用基因组步移法获取5′侧翼区序列,通过亚硫酸盐修饰的方法分析不同品种该区域GC富集区的甲基化状况.本文成功从鲤基因组DNA中获得695 bp的IGF2b 5'侧翼区序列.已获取的IGF2b 5'侧翼区序列经过TFSEARCH分析后发现了多个转录因子结合位点和TATA框,通过BLAST比对发现,鲤IGF2b 5'侧翼区DNA序列与斑马鱼( Danio rerio) IGF2b基因相比,相似性为87％.检测该区域富含GC的序列17个位点,发现建鲤(C.c.var.jian)有2个个体的3个位点出现甲基化,而黄河鲤(C.c.haematopterus)只有1个个体1个位点出现甲基化,这说明2个品种鲤在这个区域出现甲基化修饰的几率低,也验证了这2品种在该基因该区域GC富集区是稳定的.     

鲤IGF2b基因5'侧翼区序列克隆及不同鲤该区域GC富集区的甲基化分析

鲤(Cyprinus carpio)胰岛素样生长因子2b(insulin-like growth factor 2b,IGF2b)基因为鲤IGF基因家族重要的成员,已有的研究表明5'侧翼区序列对其功能的发挥有重要作用。因此,采用基因组步移法获取5'侧翼区序列,通过亚硫酸盐修饰的方法分析不同品种该区域GC富集区的甲基化状况。本文成功从鲤基因组DNA中获得695 bp的IGF2b 5'侧翼区序列。已获取的IGF2b 5'侧翼区序列经过TFSEARCH分析后发现了多个转录因子结合位点和TATA框,通过BLAST比对发现,鲤IGF2b 5'侧翼区DNA序列与斑马鱼(Danio rerio)IGF2b基因相比,相似性为87%。检测该区域富含GC的序列17个位点,发现建鲤(C.c.var.jian)有2个个体的3个位点出现甲基化,而黄河鲤(C.c.haematopterus)只有1个个体1个位点出现甲基化,这说明2个品种鲤在这个区域出现甲基化修饰的几率低,也验证了这2品种在该基因该区域GC富集区是稳定的。     

奶牛HSP70基因3'-侧翼区多态性分析及其与生产性能的关系

以160头荷斯坦和娟姗奶牛作为研究对象,分别测定了其在不同温度条件下,直肠温度、呼吸频率、产奶量及乳成分,并进行了统计分析。同时设计引物扩增HSP70基因3’-侧翼区,通过PCR—SSCP技术分析hSPTO基因3’-侧翼区的多态性,并发现一个多态位点。结果表明：扩增片段为292bp,扩增产物有基因多态性,共发现4种基因型,分别为荷斯坦牛的AA（H）型、AB（H）型和娟姗牛的AA（J）刭、AB（J）型。其中B基因可能为抗热应激耩囚,这4种基囚型奶牛个体的生产性能差异不显著（P〉0．05）。     

LRP16基因启动子克隆及特征分析

克隆LRP16基因启动子分子,并对启动子特征进行分析,预测启动子区调控元件,为深入研究LRP16基因的表达调控机制奠定基础。在NCBI的人类基因组数据库中截取并下载LRP16基因转录起始位点5′侧翼区2.7kb的基因组序列,设计PCR引物,从健康外周血单个核细胞中扩增,利用Genomatix程序对5′侧翼区近1000bp进行启动子特征分析,获得了与GenBank序列一致,长度为2.7kb的LRP16基因启动子DNA序列,该序列具有典型的真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子特征及多个核受体结合位点,如α视黄酸受体及RAR相关孤生受体。