人工复合三倍体鲤与亲本相对DNA含量及倍性分析

本文通过显微荧光光度术测量了人工复合三倍体鲤的红细胞及亲本红鲤、红鲫与散鳞镜鲤个体的红细胞和精子的相对DNA含量。结果表明：每一种亲本的精子DNA含量是其红细胞DNA含量的二分之一,人工复合三倍体鲤DNA含量等于三个亲本精子DNA含量之和,为三个亲本血液红细胞DNA含量之和的二分之一。以外周血淋巴细胞制备染色体标本,人工复合三倍体鲤染色体数为150,其亲本红鲤、红鲫和散鳞镜鲤的二倍体染色体数均为100。研究进一步证明人工复合三倍体鲤与二倍体亲本的染色体倍性和相对DNA含量存在着明显的相关性。     

人工复合三倍体鲤鱼多精受精的细胞学基础研究(英文)

为了获取一个可育的、没有遗传分离的、快速生长的养殖品系,我们通过人工方法诱导了人工复合三倍体鲤鱼。它含有两套鲤鱼（一套是散鳞镜鲤、一套是兴国红鲤）和一套鲫鱼（红鲫）共三套完整的染色体组。在这种复合三倍体中,发现有些受精卵具有罕见于硬骨鱼类中的受精生物学现象,即多精受精。这是一个非常有趣的生物学现象。为了了解其潜在的机制,我们以普通红鲤作为父本、经过干法授精,通过扫描电子显微镜对其受精的早期过程进行了超微结构研究,并以普通二倍体鲤鱼受精的早期过程作为对照。（１）通过对三次产卵季节收集的近１０００余粒未受精的成熟人工复合三倍体卵细胞进行观察,发现：每个成熟卵子在其动物极上只有一个敞开的受精孔。它由前庭和精孔管组成。前庭对外开口的平均半径为１０～１２微米。精孔管的外孔径为３．００～３．５０微米（Ｆｉｇ．Ａ＆Ｂ）,只比精子头部直径（２．８０～３．００微米）稍大一点。排除了人工复合三倍体鲤鱼成熟卵细胞一次允许两个精子并排进入的可能性。（２）人工复合三倍体鲤鱼在受精后约１５～３０秒,可以看见大量精子聚集在受精孔的前庭区域（Ｆｉｇ．Ｃ）。而在卵子表面的其它区域,没有发现有精子附着的现象。表明：在受精孔的前庭区域有一些吸引     

人工诱导异源四倍体和倍间三倍体白鲫的红细胞观察及其相对DNA含量测定

染色体核型分析表明,异源四倍体白鲫含有两套白鲫染色体和两套红鲫染色体,新四倍体白鲫含有三套白鲫染色体和一套红鲫染色体,倍间三倍体白鲫含有二套白鲫染色体和一套红鲫染色体。为进一步阐明人工诱导多倍体的染色体倍性与细胞和细胞核及其相对DNA含量之间的相关关系,作者测量了异源四倍体、新四倍体和借间三倍体鱼红细胞及其核的大小,同时测定了它们的红细胞相对DNA含量,并与它们亲本红细胞及其精子细胞相对DNA含量进行了比较。       

鲤鲫人工多倍体谱系中同工酶和蛋白的基因表达

通过对红鲤、红鲫、镜鲤、鲤鲫杂种二倍体一代,二代,鲤鲫杂种三倍体,鲤鲫复合三倍体,鲤鲫杂种四倍体一代,二代的同工酶及蛋白电泳谱型和扫描数据分析表明,在鲤鲫人工多倍体谱系中,亲代的等位基因在杂交子代中共有四种表达模式;（1）两亲本基因在子代中共同表达,即共显表达;（2）父本的基因表达受到部分或完全的抑制,即母本的基因优先得到表达;（3）母本的基因表达受到抑制,父本的基因得到表达;（4）双亲本的基因表达均受到一定程度的抑制或都不表达。其中第一种表达模式是主要的模式。根据以上基因在杂交子代中的表达特点,可用同工酶和蛋白电泳图谱将鲤鲫人工多倍体谱系的各种生物型逐一加以区分。     

人工复合三倍体鲤卵的受精的生物学研究

本文对人工复合三倍体鲤成熟卵的受精生物学进行了研究。结果表明,三倍体卵体壳具有凸凹不平的表面,与正常二倍体卵比较有明显差异。受精生物学观察发现有些卵为多精受精,进入卵的所有精子都能形成雄性原核,排出一个极体,但绝大部分受精卵在发育期间分裂不齐、畸形、直至死亡,只有具有三套完整染色体的卵子的雌核才能发育成为三倍体个体。三倍体鲤的成熟分裂不是完全的均等分裂,有些不等分裂的卵母胞核中只有两套染色体,或一     

由鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus)染色体组叠加构建的 两个单性人工多倍体克隆

具有天然雌核发育的多倍体杂种鱼可防止杂种优势的分离并保持其后代的杂种优势. 由于假设诱发的多倍体鱼类的生殖模式是天然雌核发育的, 我们进行了鲤鲫杂种的多倍体诱发, 目的是描述经染色体组叠加由有性鲤鲫二倍体转化为异源三倍体及异源四倍体克隆谱系. 鲤鲫杂种产生未减数而具有两亲本染色体组杂种卵子, 未减数的雌核可与入卵的雄核融合叠加形成三倍体合子. 鲤鲫异源三倍体胚胎发育正常, 部分异源三倍体雌性个体可产生未减数的、仍保留母本的三套染色体的成熟卵子. 绝大部分鲤鲫异源人工三倍体个体的成熟卵子的雌核不与入卵的雄核融合, 具有天然雌核发育特性. 异源三倍体卵子在入卵精子的激动下由雌核发育产生全雌后代, 并形成一个单性克隆系, 后代保留异源三倍体母本的形态特征, 并靠雌核发育的生殖方式形成异源三倍体克隆系. 极少数异源三倍体个体的成熟卵子的雌核可与入卵的雄核融合, 再通过染色体组叠加形成鲤鲫异源四倍体. 所有异源四倍体的雌性产生未减数的、含有4个染色体组的成熟卵子. 异源四倍体的成熟卵子保持雌核发育特性, 在近类的精子诱发下产生单性后代, 形成一个异源四倍体单性克隆.     

人工复合三倍体鲤卵的受精生物学研究

本文对人工复合三倍体鲤成熟卵的受精生物学进行了研究。结果表明,三倍体卵外壳具有凸凹不平的表面,与正常二倍体卵比较有明显差异。受精生物学观察发现有些卵为多精受精,进入卵的所有精子都能形成雄性原核,排出一个极体,但绝大部分受精卵在发育期间分裂不齐、畸形、直至死亡,只有具有三套完整染色体的卵子的雌核才能发育成为三倍体个体。三倍体鲤的成熟分裂不是完全的均等分裂,有些不等分裂的卵母胞核中只有两套染色体,或一套染色体,甚至是一套半染色体。     

应用微卫星标记对不同基因组组合生物型遗传多态性的研究(英文)

微卫星ＤＮＡ在真核基因组中分布频率为每２０～３０ｋｂ一个,具有片段长度短、序列 高度重复、种类多以及高度多态的特点,极适于遗传变异研究。本文报道：采用微卫星 标记对不同基因组组合的鱼类进行了基因组指纹图谱构建。受试材料为红鲤（ＲＣ）、红鲫 （ＲＡ）、镜鲤（ＭＣ）、鲤鲫杂种二倍体（ＣＡ）鲫鲤杂种三倍体（ＣＡＡ）,人工复合三倍体（ＣＣＡ） 等六种生物型。微卫星ＤＮＡ座位（探针）ＭＦＷ２、ＭＦＷ８和ＭＦＷ１６各自存在１２、１６和 １０个等位基因（Ｆｉｇ．１,２,＆３）。通过对微卫星标记图谱的量化分析,利用ＵＰＧＭＡ构建了 不同生物型的遗传关系树系图（Ｔａｂｌｅ　１,Ｆｉｇ．４）。本研究发现,徽卫星和ＲＡＰＤ分析两种 手段反映六种生物型之间的聚类模式完全一致。然而由微卫星标记获得的生物型内和生 物型之间的遗传距离均大于ＲＡＰＤ的,此结果表明微卫星标记在揭示群体内个体间差 异上有独到之处。     

人工诱导兴国红鲤三倍体最佳诱导条件的研究

采用冷休克处理兴国红鲤受精卵诱导产生三倍体鱼 ,初步探讨了获得三倍体兴国红鲤的最佳诱导条件 ,即最恰当的诱导温度 ,最恰当的诱导起始时间 ,最恰当的冷休克处理时间。结果表明 ,在人工授精后 5～ 8min ,将受精卵置于 0～ 2℃的冰水中冷休克处理 1 0～ 1 5min ,再迅速回温至正常水温 ( 2 0～ 2 5℃ )的水中发育 ,可以获得 ( 70± 5) %的三倍体兴国红鲤胚胎 ,孵化率为 50 %～ 70 % ,成活率可达 4 0 %～50 %以上 ,此为采用冷休克技术人工诱导兴国红鲤三倍体的最佳条件。     

从ATPase8-6基因研究杂交多倍体鱼线粒体母性遗传

异源四倍体鲫鲤是世界上首例人工培育的两性可育并形成群体的且能自然繁殖的四倍体鱼。本文采用质粒克隆测序法测定了红鲫、异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤的ATPase8和ATPase6基因全序列 ,结合鲤鱼、日本白鲫和斑马鱼的同源序列 ,对不同倍性水平鲤科鱼类的ATPase8和ATPase6基因进行了比较 ,分析了碱基组成、变异情况以及核苷酸和氨基酸序列差异。红鲫、鲤鱼、异源四倍体鲫鲤、日本白鲫、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤之间的序列差异为 0 0 % - 1 3 4 % ,它们与外群斑马鱼之间的序列差异为 2 7 9% -31 0 %。用MEGA软件中的MP法、ME法、NJ法和UPGMA法构建分子系统树 ,得到了相似的拓扑结构。结果分析表明 ,人工杂交多倍体异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和三倍体湘云鲤在线粒体ATPase8和ATPase6基因上具有严格的母性遗传特征。值得注意的是 ,异源四倍体鲫鲤经过 1 1代的繁育后 ,与其原始母本红鲫仍然保持了非常高的同源性 ,说明了新的异源四倍体基因库在线粒体ATPase8和ATPase6基因上拥有稳定的遗传特性。对不同倍性鲤科鱼类线粒体ATPase8和ATPase6基因的研究表明 ,ATPase8和ATPase6基因是杂交鱼后代遗传变异研究的一个很好的分子标记     

利用流式细胞光度术鉴定苹果倍性的研究

利用流式细胞光度术测定了苹果１２个二倍体,５个三倍体细胞ＤＮＡ含量。结果表明：二倍体细胞核ＤＮＡ含量平均为２．２７ｐｇ,三倍体细胞核ＤＮＡ含量平均为３．１３ｐｇ。     

人工诱导荷包红鲤雌核发育子代与亲本的染色体组型及几种酶的组织化学比较

作者使用元江鲤失活的精子,诱导荷包红鲤卵子进行雌核发育所获得的子代,同亲本作了染色体组型和几种酶的组织化学比较。雌核发育子代的染色体组型与母本荷包红鲤完全相同,与父本元江鲤有不同。元江鲤的体色黑灰色,是由于肌肉中有酪氨酸酶存在,能将酪氨酸氧化成黑色素的缘故;荷包红鲤肌肉中无此酶,不能形成黑色素,所以体色呈桔红色;雌核发育子代肌肉中,也无酪氨酸酶,其体色同母本一样为桔红色;乳酸脱氢酶、非特异性酯酶的分布和含量也都与母本一致,与父本有差异。     

银鲫复合种外源遗传物质整入的RAPD分析

在优化ＲＡＤＰＤ检测条件的基础上,采用４０对随机引物,比较分析了银复合物,异育银鲫和兴国红鲤相互间扩增ＤＮＡ片段的异同性。总的来说,银鲫复合种和异育银鲫具有基本一致的扩增产物,而与兴国红鲤的扩增产物多数不同,相似率分析表明,银鲫复合种与兴国红鲤之间的相似率为３１．６％,异育银鲫与兴国红鲤之间的相似率为２８．６％。在分析中,除发现银鲫复合种,异育银鲫与兴国红鲤间共有扩增片段外,还发现了银鲫复合种与兴     

异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们父母本线粒体DNA 12S rRNA基因遗传变异的分析

采用质粒克隆测序方法,获得了异源四倍体鲫鲤5个个体、异源四倍体鲫鲤雌核发育二倍体后代2个个体、三倍体湘云鲫2个个体及红鲫、湘江野鲤和日本白鲫各1个个体的线粒体DNA 12S rRNA基因的全序列。经对比发现,异源四倍体5个个体共享2种单元型,异源四倍体鲫鲤雌核发育二倍体后代2个个体、三倍体湘云鲫2个个体以及红鲫、湘江野鲤和日本白鲫各1个个体分别共享1种单元型。用MEGA 1.0 软件分析了它们的碱基组成和核苷酸序列差异,用邻接法构建系统进化树。它们间的序列同源性在95%~99%之间,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们母本（分别为红鲫和日本白鲫）之间的序列同源性大于异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和它们父本（分别为湘江野鲤和异源四倍体鲫鲤）之间的序列同源性,结果表明：异源四倍体鲫鲤和三倍体湘云鲫在线粒体DNA 12S rRNA基因上具有母性遗传特征。本研究另一值得注意地方的是异源四倍体鲫鲤经过9代(F3-F11)繁殖后,在5个个体中发现了2种单元型,说明在四倍体基因库中存在遗传多样性,为四倍体基因库的繁殖、保护和种群复壮提供了一些有价值的信息。     

二倍体鲫鲤F2产生不同倍性卵子的证据

在检测到鲫鲤F2产生3种不同大小(直径分别为0.13 cm,0.17cm和0.2 cm)类型的卵子基础上,进行了F2(♀)×红鲫(♂)及F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)的交配实验.通过染色体计数和流式细胞仪分析,在F2(♀)×红鲫(♂)后代中获得了四倍体、三倍体、二倍体鱼;在F2(♀)×四倍体鲫鲤(♂)后代中获得了四倍体和三倍体鱼.这两个交配组合后代中出现的不同倍性的鱼类为证明鲫鲤F2能产生三倍体、二倍体和单倍体卵子提供了进一步证据.F2(♀)×红鲫(♂)中雄性四倍体鱼的存在说明在四倍体后代中存在基因型为XXXY的个体.对上述两个交配组合后代的四倍体鱼和三倍体鱼的性腺结构观察表明四倍体鱼是可育的,而三倍体鱼是不育的.作者认为鲫鲤F2能够产生二倍体和三倍体卵子与核内复制机制和生殖细胞的融合有关.     

四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫染色体减数分裂观察

用精巢细胞直接制片法观察了异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫、湘江野鲤精母细胞染色体第一次减数分裂中期配对情况 ;作为对照 ,观察了上述四种鱼肾细胞的有丝分裂中期染色体。在精母细胞第一次减数分裂中 ,异源四倍体鲫鲤同源染色体两两配对 ,形成 10 0个二价体 ,没有观察到单价体、三价体和四价体 ;三倍体湘云鲫精母细胞形成 5 0个二价体和 5 0个单价体 ;红鲫和湘江野鲤精母细胞分别形成 5 0个二价体。肾细胞检测表明异源四倍体的染色体数目为 4n =2 0 0 ;湘云鲫为 3n =15 0 ;红鲫和湘江野鲤分别为 2n =10 0。减数分裂时染色体分布情况与肾细胞染色体检测结果相吻合。具有四套染色体的异源四倍体鲫鲤在减数分裂中只形成 10 0个二价体 ,而不形成 2 5个四价体或其它形式 ,为产生稳定一致的二倍体配子提供了重要的遗传保障 ,也为人工培育的异源四倍体鲫鲤群体能够世世代代自身繁衍下去提供了重要的遗传学证据。三倍体湘云鲫在减数分裂过程中出现二价体、单价体共存 ,同源染色体在配对和分离中出现紊乱 ,导致非整倍体生殖细胞的产生 ,为湘云鲫的不育性提供了染色体水平上的证据     

三倍体湘云鲫2号线粒体DNA含量与其不育的相关性研究

三倍体湘云鲫2号是通过倍间杂交产生的一种多倍体鱼(红鲫(♀)×异源四倍体鲫鲤(♂)),因其不育性状,具有重要的生产和科研价值。有研究表明线粒体在动物育性的分子调控机制中扮演了重要角色,但在鱼类中尚没有相关的研究报道。利用本实验室特有遗传背景清晰的实验鱼品系(三倍体湘云鲫2号、二倍体红鲫、异源四倍体鲫鲤和同源三倍体鲫),通过荧光定量PCR技术对比分析了它们性腺中线粒体DNA的拷贝数,发现三倍体湘云鲫2号雄性个体精巢中mt DNA含量较正常水平高,雌性个体卵巢中mt DNA含量较正常水平低。实验首次从线粒体DNA含量影响生殖细胞发育的角度探索线粒体与三倍体湘云鲫2号不育的关系,为三倍体湘云鲫2号不育分子机制的研究提供了一些新的基础数据。     

酵母融合菌株的构建及其特性研究

以酿酒酵母和糖化酵母为亲本,通过正交实验优化了亲本原生质体的制备,再生以及融合的最佳条件,由此获得了既具有糖化能力又可产高浓度酒精的稳定的酵母融合菌株。融合株的体积较亲株大,ＤＮＡ含量与两亲株ＤＮＡ含量之和相当,淀粉水解能力,葡萄糖发酵效率,生长速率及产酒精能力等均优于亲株     

乌鳢三倍体诱导及其生长

采用热休克抑制第二极体排放的方法诱导乌鳢(Channa argus)三倍体,以探索人工诱导乌鳢三倍体的理想热休克条件。采用DNA含量测定法和红细胞核大小鉴定法对获得的鱼苗倍性进行鉴定,同时对普通二倍体乌鳢群体与三倍体群体的生长差异进行了比较研究。结果表明,(1)热休克法适宜诱导条件为,(28±0.5)℃培育水温授精后4 min,在水温42℃条件下持续处理3 min,三倍体诱导率最高,达到87.69%;(2)三倍体与二倍体DNA含量差异极显著(P0.01),其比值为1.50︰1.00;(3)三倍体和二倍体在红细胞核长径、红细胞核体积、红细胞核面积等6项指标上存在极显著差异(P0.01);与二倍体相比,三倍体红细胞体积和核体积分别是其1.69倍和1.60倍;(4)在4月龄与8月龄,三倍体的体长和体重比二倍体稍高,但两者差异不显著(P0.05)。本实验结果为进一步开展乌鳢倍性育种奠定了基础。     

应用RAPD技术对不同基因组组合生物型遗传多态性的研究(英文)

利用ＲＡＰＤ技术对不同基因组合的鱼类进行了基因组指纹图谱构建,在ＤＮＡ水平上对基因组成分进行了分析,探讨了其遗传多态性。ＲＡＰＤ结果发现,在２６个随机引物扩增的产物中,平均每个个体观察到约１４２个ＲＡＰＤ标记,单个引物获得的标记平均为５．４。其中４个引物扩增的图谱可将不同的生物型区分开：Ｓ－２６引物的扩增图谱（Ｆｉｇ．１）可将红鲫（ＲＡ）与其它组合区分开,还可将鲤鲫杂种一倍体（ＣＡ）与鲫鲤杂种三倍体（ＣＡＡ）和人工复合三倍体鲤（ＣＣＡ）区分开;Ｓ－８引物（Ｆｉｇ．２）可区分开红鲤（ＲＣ）和镜鲤（ＭＣ）;Ｓ－４５引物（Ｆｉｇ．３）可区分开ＲＣ和ＣＡ;Ｓ－２２引物则可区分开ＣＡＡ和ＣＣＡ。六种生物型均存在基因组特异性的图谱即各自独特的“诊断性”图谱,作者由此建立了详细的分子标记检索表（Ｔａｂｌｅ１）。通过对ＲＡＰＤ图谱的量化分析,利用ＵＰＧＭＡ构建了不同生物型的遗传关系树图;反映了鲤鲫及各种组合生物型之间的遗传相似关系：ＲＣ和ＭＣ属同一种系,聚为一族;ＣＡＡ和ＣＡ基因组类型相同,聚为一族;ＣＣＡ虽自成一体,但可与ＣＡＡ和ＣＡ聚为一族;而ＲＡ与其它组合遗传距离较远,自成一族。ＲＡＰＤ的结果也表明各种生物型内个体间