一株木霉产生菊粉酶的研究

从土壤中分离到一株木霉(Trichoderma sp.)Fx-1,能产生较高活性的菊粉酶(Inulinase)。该酶能被菊粉(Inulin)诱导,而不被蔗糖、棉子糖、纤维素、葡萄糖或果糖诱导,在适宜的培养条件下,酶活性可达64u/ml。5%的菊粉在pH5,0、温度50℃条件下,12小时内几乎100%被该酶所水解。酶解总糖中,果糖占92.3%,葡萄糖占5.8%。酶在60℃下保温10分钟,其活性不变。     

一株木霉产生菊粉酶的研究*

从土壤中分离到一株木霉(Trichoderma sp.)Fx-1,能产生较高活性的菊粉酶(Inulinase)。该酶能被菊粉(Inulin)诱导,而不被蔗糖、棉子糖、纤维素、葡萄糖或果糖诱导,在适宜的培养条件下,酶活性可达64u/ml。5%的菊粉在pH5,0、温度50℃条件下,12小时内几乎100%被该酶所水解。酶解总糖中,果糖占92.3%,葡萄糖占5.8%。酶在60℃下保温10分钟,其活性不变。     

哈茨木霉产纤维素酶菌株筛选及培养基优化

[目的]以微晶纤维素为底物,从宝天曼自然保护区采集的腐木和土壤中筛选产纤维素酶活高的真菌,并优化其培养基配方。[方法]通过微晶纤维素平板上产生的透明圈大小进行初筛,和滤纸酶活复筛,并通过响应面法优化其发酵培养基。[结果]筛选到一株酶活较高的菌株,经18S r DNA序列分析鉴定为哈茨木霉,命名为哈茨木霉D-8,通过响应面分析法优化后的培养基配方为木糖渣2. 86%,麸皮2%,微晶纤维素0. 48%,(NH4)2SO40. 32%,KH2PO41%,MgSO40. 04%。[结论]滤纸酶活从优化前的4. 32 IU/m L提高到5. 53 IU/m L,使其纤维素酶活提高了28%,其培养基的优化为哈茨木霉D-8的发酵生产奠定了应用基础。     

一株耐冷玫红假裸囊菌HD1031的鉴定及其所产纤维素酶的研究

[目的]以纤维素为唯一碳源,从四川省阿坝自治州黄龙沟的高山低温环境中分离筛选产纤维素酶的耐冷菌,并研究菌株的产酶特征.[方法]根据菌株的ITS序列分析及形态特征,对菌株进行鉴定.利用DNS法测定纤维素酶酶活性.[结果]从四川省阿坝自治州黄龙沟的高山腐殖土中筛选出一株产纤维素酶的耐冷菌HD1031,经鉴定该菌为玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus).该菌可在4℃-25℃生长,最适生长温度为16℃-17℃.该菌在以微晶纤维素和玉米芯粉为碳源、硫酸铵和Tryptone为氮源的培养基中,17℃、160 r/min摇瓶发酵8d后产生纤维素酶,其中内切葡聚糖酶酶活为366.67 U/mL,滤纸酶酶活87.6 U/mL,β-葡萄糖苷酶酶活90.8 U/mL,酶最适反应pH为6.0,最适反应温度为50℃.[结论]筛选获得一株产纤维素酶的耐冷菌HD1031,此菌株所产纤维素酶在20℃-40℃下活性较高,对热敏感,具有低温纤维素酶的特点.     

高效低成本纤维素酶诱导物的制备、筛选及应用

本研究利用玉米芯、甘蔗渣、脱木素木糖渣及粗纤维诱导里氏木霉产纤维素酶,对4种材料进行成份测定,然后以逐步添加的方式与微晶纤维素混合诱导里氏木霉产纤维素酶,和使用微晶纤维素诱导产酶对比,玉米芯含有的纤维素代替总纤维素的50%时,酶活力降低2个单位,蛋白减少0.8 g左右,其酶水解能力降低0.4%,对其产纤维素酶的水解能力没产生不利影响。甘蔗渣纤维素替代量可以达到30%,酶活力有1个单位的降低,蛋白分泌降低0.5 g左右,酶的水解能力提高7%左右。脱木素木糖渣纤维素替代量也可达到50%,酶活力和蛋白降低分别达到0.5个单位和0.2 g左右,酶水解能力降低了4.45%。粗纤维的利用可以达到100%替代,对里氏木霉产酶的酶活力影响有0.3个单位之差,水解能力降低1.625%。这说明这几种物质可以部分替代或者完全替代微晶纤维素,诱导里氏木霉发酵产纤维素酶,特别是由玉米芯和甘蔗渣制备的脱木素木糖渣和粗纤维有着较高的应用前景。该研究对降低纤维素酶的生产成本及其工业化应用具有重要意义。     

胶原蛋白酶产生菌的筛选及酶的分离纯化

从堆积骨骼的土样中筛选出高产胶原蛋白酶的MBL13菌株,经鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。对其所产的胶原蛋白酶BCC进行分离纯化,并进行酶学性质的研究。从菌株的发酵液中纯化出分子量约为38.0kDaBCC酶。酶反应的最适温度为40℃,最适pH为8.0。在50℃以下稳定,60℃保温1h酶活仅保留10%;在pH7.0～8.5活性较稳定;金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+对酶有激活作用,金属离子Cu2+对酶有显著的抑制作用。EDTA和EGTA能抑制该酶,表明BCC酶为一种金属蛋白酶。酶的底物特异性表明该酶为骨胶原蛋白酶,且对Ⅰ型骨胶原蛋白水解能力极显著高于Ⅱ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白。将纯化的BCC酶应用于骨胶原蛋白的水解可以得到不同链长的多肽,其水解能力高于标准品胶原酶Ⅰ型。本研究为工业酶提供了新的菌株和新型胶原蛋白酶,为胶原蛋白酶的开发提供了重要的理论依据。     

一种耐热几丁质酶的产生及其稳定性研究

疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)SY2 在以胶状几丁质为唯一碳源的诱导培养基中产生了胞外几丁质酶.该酶在50℃保温1 h,酶活稳定;65℃时半衰期为25 min;酶液在室温下保存到12周,残余酶活性为45%左右.该酶有较宽的pH范围,3.0～9.0之间保持稳定,pH值为2.5时,仍具有70%的剩余酶活性.Ca2 对几丁质酶的活性有显著的激活作用;高浓度变性剂对酶有抑制作用.结果表明该酶是一种热稳定性高且耐酸碱的新型几丁质酶,能在酸性和高温环境中发挥作用,这些特性赋予了T.lanuginosus几丁质酶在几丁质的生物转化及其它生物技术中极大的应用优势.     

裂解性多糖单加氧酶HcLPMO与纤维素酶协同降解纤维素

【目的】为研究HcLPMO的活性测定方法及其与纤维素酶的协同降解特性。【方法】利用大肠杆菌表达系统进行HcLPMO异源表达,研究以AmplexTM Ultra Red为荧光底物的LPMOs活性检测条件;研究HcLPMO与纤维素酶最优配比协同降解微晶纤维素及其他多种生物质底物的能力。【结果】表达条件确定最适装液量为20%,最适诱导温度为20°C。活性测定研究结果表明HcLPMO需先与铜离子结合才具有活性,电子供体抗坏血酸钠(ASC)最适浓度为10–4 mol/L,并发现AmplexTM Ultra Red浓度以及辣根过氧化物酶浓度对酶活的检测影响较小。HcLPMO与纤维素酶协同降解微晶纤维素研究确定HcLPMO与纤维素酶最优配比为2:3,葡萄糖产量相较纤维素酶单独作用提高了99.48%。此外,针对多种生物质底物,发现该酶与纤维素酶的复配体系对汽爆玉米秸秆和微晶纤维素的协同降解效果较好,相较于单独用纤维素水解酶,葡萄糖产量分别提高了63.81%和59.43%,而对碱处理玉米芯和木薯渣降解效果次之,葡萄糖产量仅分别提高35.41%和11.06%。【结论】HcLPMO与纤维素酶复配能够有效提高酶法降解纤维素效率;而底物前处理如蒸汽爆破或碱处理对于HcLPMO与纤维素酶协同降解木质纤维素影响较大。     

L-谷氨酸氧化酶与CBD的融合表达及其在微晶纤维素上固定化分析

酶的固定化作为一种重要的技术,已在生物催化领域得到了广泛的应用。现将来源于普拉特链霉菌3304(Streptomyces platensis NTU3304)产生的胞外L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase,Gox)基因gox融合到来源于粪碱纤维单胞菌Cellulomonas fimi的纤维素结合域(CBDcex)的基因上,构建表达载体p ETM10-Gox-CBD,并在大肠杆菌中表达。通过蛋白纯化获得融合蛋白,并命名为Gox-CBD。利用CBD对微晶纤维素特异性吸附的特性将其固定在微晶纤维素上,并对固定化酶的制备条件、结合量、酶学性质及其微晶纤维素结合稳定性等进行了研究。在4℃条件下结合约1 h,融合蛋白Gox-CBD结合在纤维素上的结合量即可达到9.0 mg/g。通过对重组型、融合表达游离的以及固定化在微晶纤维素上的谷氨酸氧化酶的酶学性质进行比较发现,固定化酶的比酶活有所降低;但固定化酶的热稳定性相对于游离酶有了很大的提高,在60℃孵育30 min后还保留有约70%的活性,而游离的重组Gox在相同条件下几乎完全失去活性。当固定化结合蛋白在p H10或者盐浓度5 mmol/L的Na Cl条件下可以牢固结合。并且可以通过一步纯化方法固定化融合蛋白Gox-CBD于微晶纤维素上。因此,L-谷氨酸氧化酶与纤维素结合域融合表达的研究为蛋白的纯化及酶的固定化提供了一种新策略。     

微生物凝乳酶的研究 Ⅱ.酶学性质

从2502株菌中筛选到一株真菌Y85-8512经诱变育种,发酵物的凝乳酶活力为5000 u/g以上。对该酶的酶学性质进行了研究,其最适反应温度为70℃,酶在50℃保温半小时稳定;pH 5.0时酶活最高,pH 7.0酶几乎失活;pH 2—5,室温保持1小时,剩余酶活力为66—100%。该酶凝乳活性与水解蛋白质活性之比为4782。还与胃蛋白酶、小牛凝乳酶及毛霉凝乳酶进行了比较,初步认为该酶不同于这几种酶。     

微生物凝乳酶的研究 Ⅱ.酶学性质

从2502株菌中筛选到一株真菌Y85-8512经诱变育种,发酵物的凝乳酶活力为5000 u/g以上。对该酶的酶学性质进行了研究,其最适反应温度为70℃,酶在50℃保温半小时稳定;pH 5.0时酶活最高,pH 7.0酶几乎失活;pH 2—5,室温保持1小时,剩余酶活力为66—100%。该酶凝乳活性与水解蛋白质活性之比为4782。还与胃蛋白酶、小牛凝乳酶及毛霉凝乳酶进行了比较,初步认为该酶不同于这几种酶。     

基于密码子优化的FAD依赖葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质

旨在获得表达量高的FAD依赖的葡萄糖脱氢酶。通过FAD依赖的葡萄糖脱氢酶密码子优化,人工合成基因片段,构建重组表达载体pMD-GDH,转化毕赤酵母X33菌株后利用甲醇诱导培养实现分泌表达。结果显示,经试管水平筛选阳性转化子获得一株酶活高且稳定的重组菌株,在10 L发酵罐培养时经过136 h诱导培养,酶活达到257 600 U/L。酶学性质分析表明,以葡萄糖为底物时最适温度和pH分别为55℃和7.0,在50℃下处理150 min仍有70%的活性,在pH 4-7范围内,37℃保温4 h,FAD-GDH仍能保持50%以上的活性。金属离子Cu~(2+)对酶活抑制作用比较大。FAD-GDH的底物专一性较好,以葡萄糖为最适底物。经毕赤酵母密码子偏好性优化实现了FAD依赖的葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的高效表达,为应用于血糖检测提供理论依据。     

固氮鱼腥藻的蛋白水解酶及其部分性质的研究

应用溶菌酶处理,超声破碎细胞,通过差异离心和解离剂处理,将细胞的不同部分分开。以水解α-酪蛋白反应检测蛋白水解酶活性,结果表明,在细胞的可溶部分、内细胞质膜、外膜及胞浆周围区均存在蛋白水解酶活性。异形胞可溶部分的蛋白酶活比营养细胞可溶的蛋白酶活高4—5倍。在固氮条件下,营养细胞可溶性蛋白酶反应最适温度为50—55℃,65℃时,酶活迅速下降。有Ca^2 5mmol／l时,蛋白酶在60℃稳定,无Ca^2 存在下,酶液在60℃预处理10分钟,酶活性丧失80％以上。酶反应的最适pH为8—10。而且氮饥饿之后,培养基的pH值对细胞蛋白酶活水平有明显影响,氮饥饿24小时内,蛋白酶活迅速增加,但在碱性条件下,酶活水平比在中性条件下要高得多。邻菲哕啉对蛋白酶活性有严重的抑制,EDTA仅有轻微抑制,而PMSF对细胞蛋白酶活的抑制作用,与细胞氮饥饿时间有关。     

碳源组合方式对粉刺侧孢霉产木素过氧化物酶的影响

粉刺侧孢酶（ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）以微晶纤维素（０３８％）为主要碳源,辅之以培养的００２％葡萄糖为菌丝体形成初期碳源,能获得相当高的木素过氧化物酶（Ｌｉｐ）酶活,０３５Ｕ／ｍｌ。相反,以０４％微晶纤维素的单一碳源,仅得０１１Ｕ／ｍｌ酶活说明,这种碳源分段（组合）模式,能产生高酶活;其机理可能主要是由于分段加入碳源,引起“暂时性低碳”,刺激了木素过氧化物酶（Ｌｉｐ）更多地合成。另外,与０４％微晶纤维素为单一碳源比较,以少量葡萄糖为起始碳源,有利于生物量的快速形成并提高生物量,可能也是导致较高酶活的原因。     

一种不对称水解（R,S）-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯的新酯酶基因的克隆表达和酶学性质研究

本文将来自反硝化无色杆菌Achromobacterdenitrificans1104的酯酶基因EHest,转化大肠杆菌中,成功表达了具有不对称水解农药甲霜灵的中间体(R,S)-2,6-二甲基苯基氨基丙酸甲酯( MAP )活性的酯酶EHesterase。用重组酯酶EHesterase催化MAP 的水解,底物浓度50 g/L,反应1h的转化率29.5%,产物( R-酸)的eep 是85.1%。该酶的最适反应pH和温度分别为9.0和50℃,在50℃以下和pH5~9之间具有较好的稳定性。该酶水解MAP 的米氏动力学参数Vm、Km 分别是0.733 g/(L·min)和7.49 g/L。加入10%DMSO对酶EHesterase的立体选择性和催化速度有一定的促进作用。 Cu2+、Fe3+对酶活有明显抑制作用。该酶水解MAP 的活性与水解p-对硝基苯乙酸酯的活性数量级相当,是水解橄榄油活性的333倍。     

低温耐热脂肪酶的筛选、纯化及特性研究

目的:对一株低温耐热脂肪酶产生菌Pseudomonas RT-7进行产酶、纯化和特性研究.方法和结果:该菌的发酵液经50%硫铵沉淀、DEAE-Sepharose及Sephacryl S-100分离获得了纯化的脂肪酶(PL-7).SDS-PAGE电泳估算其表观分子量为44kDa,对底物特异性、作用温度、作用pH和耐热性的研究表明该酶为碱性脂肪酶,最适温度在15～20℃.该酶对C≤12链长的甘油三酯有较好的水解能力.该酶具有在低温和高温下稳定而在中温下不稳定的特点:表现为该酶经60℃30min处理后残余酶活高达93.33%,90℃处理30min后残余酶活仍有35.19%,而在40℃处理30min酶活仅残余28.23%.结论:该酶为低温碱性脂肪酶并在高温条件下具有很好的耐热性.     

来自拟青霉属真菌的壳聚糖酶的分离纯化、理化性质及降解产物的分析(英文)

从来自拟青霉属真菌Paecilomyces sp.CS-Z的发酵液中获得一种壳聚糖酶,该酶被纯化了9.4倍,产率为48.2%。经SDS-PAGE分析确定为单一条带,分子量为29kDa,其最适pH为6.0–6.5,最适温度为55℃,在80℃处理60min后,能保持较好的热稳定性,Hg2+完全抑制了酶活,对脱乙酰度85%–95%的壳聚糖具有较高的水解活性,而对几丁质和羧甲基纤维素无活性。薄层层析和质谱分析表明该酶是一种内切酶,其水解产物为聚合度大于6的壳寡糖,其理化性质与至今报道的壳聚糖酶有所不同,为壳聚糖酶的开发提供了重要的实验依据。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶补料发酵及其特性研究

采用正交实验设计对枯草芽孢杆菌产 β-甘露聚糖酶的培养基组成和培养条件进行优化 ,在此基础上进行摇瓶补料发酵 ,酶活达223.47U/mL ,较未补料的酶活提高了 32 90 %。酶反应的最适pH为 6 5 ,最适温度为 70℃ ;该酶在pH 5.0～10.0和 70℃以下稳定。水解魔芋胶产物主要为二糖以上低聚糖。     

粉刺侧孢霉产木质素过氧化物酶酶活性与pH值的关系

研究了粉刺侧孢霉 (Phanerochaetechrysosporium)在以微晶纤维素为C源时 ,木素过氧化酶与 pH值的关系 .试验采用 37～ 39°C下液体振荡培养 ,藜芦醇为产酶诱导剂 ,测试不同起始 pH值所得木素过氧化物酶活性 .结果表明 ,起始 pH值 6.0所得酶活最高达 0 .1 2 6U·ml- 1 ,说明以微晶纤维素代替葡萄糖为C源 ,其最佳 pH值相对较高 .菌丝球直径与酶活呈正相关 .     

高黎贡山土壤中纤维素分解菌的筛选

为了充分利用纤维素,目前国内外对纤维素酶产生菌的研究工作得到极大发展。通过新华滤纸为唯一碳源的Hutchison液体培养基和羧甲基纤维素培养基从高黎贡山土壤中分离得到10株纤维素分解菌。以6号菌为试验菌进行了试验条件和酶活测定研究,结果表明:6号菌在50℃、pH值为7、培养6 d后具有最高的CMCase、FPAase酶活。