棕色固氮菌含铁超氧化物歧化酶重组研究

将棕色固氮菌230含铁超氧化物歧化酶对8mol/L脲,10mmol/L EDTA透析制备无活性缺辅基蛋白;将其在8mol/L脲中对10mmol/L硫酸亚铁铵透析得到重组超氧化物歧化酶。重组酶含有与天然酶相近的铁含量,活性为天然酶的89.1％。缺辅基蛋白,重组酶与天然酶都是由二个相同的亚基组成;重组酶的吸收光谱与荧光光谱与天然酶几乎一样,而缺辅基蛋白则有较大的差异;从园二色谱的分析得知,缺辅基蛋白不含有α—螺旋,而天然酶和重组酶中α螺旋的含量分别为21％和20％;缺辅基蛋白比天然酶或重组酶具有更大的巯基反应性。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的研究(五)

应用微热量计研究了棕色固氮菌固氮酶铁蛋白与MgATP或MgADP络合的热力学状况。在25℃,1大气压下铁蛋白与MgATP饱和络合时的焓(⊿H~0)变化为-4.78千卡/摩尔,自由能(AGO)变化为-6.66千卡/摩尔,熵(⊿S~0)变化为+6.31卡·度/摩尔。在铁蛋白与MgATP络合时,随着MgATP浓度的增加,-⊿H~0也随之增加呈S型曲线,铁蛋白与MgADP饱和络合时⊿H~0为-5.45千卡/摩尔,AGO为-6.89千卡/摩尔,⊿S~0为+4.82卡·度/摩尔。熵的增加表明MgATP或MgADP与铁蛋白络合后,引起铁蛋白构型的变化。铁蛋白与MgATP或MgADP饱和络合时的TASO分别为+1.88千卡/摩尔和+1.44千卡/摩尔。     

棕色固氮菌nifS敲除菌株的构建

从Azotobacter vinelandii中通过PCR扩增了5’和3’端分别缺失264bp和261bp的nifS'片段,克隆至载体pUCl8,形成重组质粒pUCS,再通过同源重组的方法,将pUCS插入Azotobacter vinelandii的nifS中,形成够阻断突变体SUl,经Southern杂交和：PCR扩增,证明所得确为nifS阻断突变株。SUl在外加氮源的BBGN培养基中能够快速生长,但在Burk's无氮培养基中,生长却极其缓慢,表明,nifS基因的破坏,已造成SU1的固氮能力接近完全丧失。该突变体的成功构建,为进一步从中纯化固氮酶两组分,研究nifS对固氮酶结构及功能的影响及iscS与nifS之间的关系奠定了良好的基础。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的研究(四)

应用荧光探剂——荧光醋酸汞和荧光胺研究了棕色固氮菌固氮酶的两种蛋白组分与MgATP和MgADP的关系。实验确证该菌钼铁蛋白不能与MgATP和MgADP络合,而铁蛋白则能。每分子铁蛋白络合2个分子MgATP,但至少是络合2个分子MgADP,反应的部位是在铁蛋白的巯基上。MgATP和MgADP与铁蛋白络合后,引起铁蛋白构型变化,使铁蛋白中可与荧光胺反应的氨基量增加。MgATP和MgADP二者与铁蛋白作用后所得结果相近似。在没有MgATP存在条件下,钼铁蛋白仍能与铁蛋白相互作用,并在巯基部位上产生变化。对于氨基也有影响。     

棕色固氮菌固氮链中的能量转化

应用Fld_(SR)天然荧光和1,5—Br—AEDANS及5—IAF荧光探针偶标记铁蛋白和钼铁蛋白作荧光测定。Fld在与铁蛋白络合时所损失能量为铁蛋白所接受。同样,铁蛋白与钼铁蛋白络合时也有能量转移现象。铁蛋白与MgATP形成复合物后仍能将能量转移给钼铁蛋白,铁蛋白与钼铁蛋白络合物间荧光标记基团距离为35～58A,铁蛋白·MgATP与钼铁蛋白间荧光标记基因距离为38～63A。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白特性的研究(三)

应用亚铁螯合剂研究了棕色固氮菌固氮酶铁蛋白中Fe_4S4_簇与Mg·ATP的关系。未变性铁蛋白与螯合剂无反应。Mg·ATP和PCMB促进铁蛋白中的铁与螯合剂的反应。Mg·ADP抑制Mg·ATP的作用。加入Mg·ATP或PCMB后1小时内有75％以上的铁被螯合,20小时内几乎全部被螯合(97％以上)。单独的ATP,ADP,Mg~( )无作用。氧钝化铁蛋白中铁能直接与螯合剂反应,Mg·ATP或PCMB浓度与反应速度的关系符合S型动力学。用Hill作图法得到斜率的为2,说明在铁被螯合前Fe_4S_4簇上(或附近)的两个位置已参与反应。Brdicka反应和羟甲基化作用结果表明钼铁蛋白与铁蛋白巯基二者的相互作用。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白两种聚合体的研究

 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白八聚体相当于两个钼铁蛋白四聚体的聚合体。在细胞生长过程中,胞内钼铁蛋白两种聚合体的相对含量出现规律性变化:在对数期,细胞固氮酶比活力成上升趋势,而钼铁蛋白主要以高活力的四聚体形式存在;在对数期结束至稳定期,细胞固氮酶比活力下降至一个低水平的稳定值,此时的钼铁蛋白基本上为八聚体形态。在细胞固氮生长时,向培养基中加入过量氨可明显地导致钼铁蛋白由四聚体向八聚体的转化。我们推断,生长过程中胞内钼铁蛋白聚合态的变化可能是调节固氮酶活力的一种方式。胞外,钼铁蛋白的两种聚合态可以相互转化。     

棕色固氮菌含铁超氧化物歧化酶的分离提纯及性质研究

本文以改进的方法提纯了棕色固氮菌——230含铁超氧化物歧化酶。产品收率提高1倍以上。该酶在pH8.2时,5℃～60℃稳定。在25℃时,pH6～12稳定。NaN_3和H_2O_2是该酶的抑制剂,而KCN对此酶活力无影响。     

棕色固氮菌钨铁蛋白中钨的测定

同位素标记表明,在几种含钼酶中的钼能以钨代替。在生物固氮研究中常用钨酸盐去阻抑棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii),以形成钨铁蛋白,以此了解钼在生物固氮中的作用。我们利用WO_4~-在1N的硫酸浓度下,并在沸水浴中煮30分钟与dithiol生成tungsten(Ⅵ)-dithiol蓝绿色络合物的特点,可准确地测得钨铁蛋白中钨含量。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白的提纯及其某些特性的研究

用DEAE-纤维素和凝胶过滤法,可将棕色固氮菌固氮酶铁蛋白组分提纯43倍,比活性述512毫微克分子NH3／毫克蛋白·分。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检定,呈均一状态,不含色氨酸、钼。每分子铁蛋白含3．89个原子Fe,分子量约64,000。氨基酸组分分析结果表明,铁蛋白中酸性氨基酸含量为碱性氨基酸含量的一倍。在380—650毫微米区内有宽的吸收带,但无明显吸收峰。     

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白某些特性的研究(二)

棕色固氮菌固氮酶铁蛋白能与Mg-ATP结合,而钼铁蛋白则不能。每分子铁蛋白结合2个分子Mg-ATP。结合常数K为13.3～15.6μM。铁蛋白与不同浓度ATP结合时符合S型动力学。铁蛋白引起结合Mg-ATP后构型变化。在未变性的铁蛋白的12个半胱氨酸残基中,只有4个可被羧甲基化,加入Mg-ATP或低浓度对氯汞苯甲酸后,只有2个半胱氨酸残基被羧甲基化。对氯汞苯甲酸抑制铁蛋白活性,先加Mg-ATP再加列氯汞苯甲酸,能保持部分活性。     

棕色固氮菌中固氮酶对氧毒害保护的初步研究

固氮酶对氧极不稳定。随着其纯度的提高,遇氧不可逆的失活现象更加明显。在自然界生长的好气性固氮菌、固氮的藻类及豆科植物的共生固氮系统中有着特殊的适应机制,这种机制可使固氮酶在有氧条件下免受氧的钝化。因此,研究固氮酶遇氧钝化的原因及好气性固氮菌所特有的氧保护机制,对固氮酶本身     

棕色固氮菌(Azotobacter Vinelandii)的氢酶

自1931年Stephenson和Sticklancl发现氢酶之后,氢酶已在各种类型的微生物中被发现。人们把发现的氢酶分为三类:可逆氢酶,通常仅见于嫌气细菌中;与固氮酶联合依赖于ATP释放氢的氢酶;和一种称谓单方向的吸收氢酶,它存在于绝大多数好气性的固氮菌     

棕色固氮菌中固氮酶的氧钝化及其保护

超声破碎得到的棕色固氮菌提取液中,铁蛋白严重缺乏。外加部分纯化的铁蛋白可以使提取液的固氮活性成倍增加。外加的铁蛋白与提取液中某些成份结合,可以经高速离心分离,其抗氧能力随之大为提高。提取液中固氮活性的抗氧能力有赖于Mg~(++)的存在,在有氧条件下提取液通过Sephadex G-25柱后立即失活,但如果在平衡和洗脱缓冲液中补以0.01M MgCl_2,固氮活性几乎可完整保存。菌体破碎时,外加适量Mg~(++),不但可以提高提取液的固氮活性,而且抗氧能力还能进一步提高。     

赤霉素荧光测定的光谱特征

通常采用水稻幼苗伸长法和荧光测定法鉴定GA_3。前者对环境条件和植物材料都要求严格一致,是一种理想的定性生物鉴定法。但是精密度不很好,而且操作费时。后者是化学定量法,其精密度高,操作方便,不过要求选择特定光谱,有利于发酵生产中间代谢主要成分的测定。该方法的原理是赤霉