地高辛标记Ucp2基因RNA探针的制备和应用

目的:制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法:提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。     

地高辛标记的黄鳝F64基因cRNA探针的制备及其应用

以黄鳝F64基因序列为模板设计引物,扩增用于c RNA探针合成的模板,构建F64/p GM-T重组质粒并线性化,利用RNA聚合酶体外转录合成正、反义c RNA探针,并对其进行地高辛标记,利用原位杂交方法检测F64基因在黄鳝性腺发育过程中的表达变化情况。结果显示,正义探针未检测到阳性信号,反义探针检测到该基因在黄鳝性腺发育早期不表达,于V期性腺开始表达。研究结果表明,体外转录法可以有效合成c RNA探针,制备的c RNA探针可以准确检测F64基因的时空表达。     

青岛文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因的组织特异性表达

为了探索文昌鱼S-腺苷高半胱氨酸水解酶AdoHcyase基因在文昌鱼组织中的表达分布情况,利用组织原位杂交技术,以地高辛标记的反义RNA为探针,检测了文昌鱼AdoHcyase基因在组织中的表达分布特点.结果表明,AdoHcyase基因在雌性文昌鱼的卵巢、肝盲囊和后肠杂交信号十分强烈,在内柱、鳃等组织中也有微弱信号表达,...     

应用RNA原位杂交技术研究马尾松针叶中银松素合酶的基因表达

以马尾松（Pinus massoniana Lamb．）银松素合酶（PS）基因为模板,体外转录合成带地高辛标记的反义RNA全长及特异探针,并用这2个探针与马尾松针叶组织石蜡切片进行原位杂交,研究该基因在马尾松针叶中的表达特性以及外界诱导因素对该基因表达的调节特性。结果表明,该基因的转录表达主要集中在针叶的韧皮部;紫外线照射和酵母提取液处理均可使该基因的转录水平明显增加。     

银松素合酶基因地高辛标记RNA探针的合成

目的:体外转录合成银松素合酶(PS)基因地高辛标记反义RNA探针。方法:通过双酶切把PScDNA全长序列接到pBlueskriptⅡKS( )的多克隆位点上;同时,经由NCBI比对确定PScDNA的特异序列,设计含有SalⅠ和XbaⅠ这2个酶切位点的上、下游引物,用PCR法扩增含有该位点的目的片段,并连接到pBlueskriptⅡKS( )的多克隆位点上;最后利用pBlueskriptⅡKS( )上的启动子T7,用T7RNA聚合酶在体外转录合成地高辛标记PS全长及特异序列的反义RNA探针。结果:通过对构建探针的单、双酶切,PCR及电泳鉴定,表明成功合成了PS基因地高辛标记的全长及特异序列的反义RNA探针。结论:RNA探针的合成为后续马尾松PS基因表达的RNA原位杂交研究打下了基础。     

WNK1基因不同转录本在小鼠肾脏中的表达及意义

目的研究WNK1基因长短两个转录本在小鼠肾脏组织中的表达分布特征,为进一步研究它们的生物学功能提供实验数据.方法 RT-PCR扩增两个转录本的特异性片段,Northern印迹杂交证实片段特异性后,将片段克隆入pGEM-T载体中,体外转录同位素标记的正义和反义RNA探针,在小鼠肾脏组织石蜡切片上进行原位杂交检测.结果 WNK1基因长转录本微弱广泛地表达在小鼠肾脏组织上,短转录本特异地表达在小鼠肾脏皮质部的远曲小管上.结论在肾脏,WNK1基因的短转录本是功能性转录本,其编码的蛋白质在生物学功能上可能与其它激酶不同.     

人U6基因POI Ⅲ启动子表达反义VEGF cDNA抑制SMMC-7721肝癌细胞VEGF表达的观察

 由 RNA聚合酶启动子在细胞内转录高浓度反义 RNA是抑制靶蛋白的一种有效手段 ,有报道 POI 启动子转录小分子 RNA存在效率不高 ,带有较多的非特异性序列等缺点 ,为了克服这些问题 ,表达反义 VEGF RNA的人 U6基因表达盒对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制作用进行了研究 .首先 PCR扩增 2 0 0 bp VEGF c DNA以正、反向插入人 U6 sn RNA.通过测序证实反向插入的正确性 .采用细胞原位杂交 ,RNA酶保护分析 ,Northern印迹来证实反义 RNA表达的情况 ,利用 RT- PCR方法研究了其对人肝癌细胞株 SMMC- 772 1 VEGF表达的抑制效果 .细胞原位杂交结果显示 U6启动子转录产物主要分布于细胞核内 ,细胞浆内亦有表达 ,RNA酶保护分析显示 U6基因 POI 启动子能高表达所需大小反义 RNA,Northern印迹结果显示脂质体 lipo-fectamine介导含 U6基因 POI 启动子的质粒转染人肝癌细胞株 SMMC- 772 1后 1 2 h即有表达且可持续表达 6 d. RT- PCR证实 U6基因 POI 启动子转录的反义 VEGF RNA能有效抑制SMMC- 772 1细胞 VEGF的 m RNA表达 .已有的研究结果揭示 POI 启动子是反义基因治疗中一种好的选择     

斑马鱼高分辨率整胚原位杂交实验方法与流程

整胚原位杂交技术是利用反义RNA探针检测体内mRNA表达的一项技术, 在利用模式动物研究基因时空表达方面有着重要的应用。如何使用该技术得到特异、高敏感度的表达结果, 对每一个使用该技术的实验室来说都很重要。本实验室参照常规的实验方法, 对该技术加以改进, 使之更加灵敏, 结果更加特异。文章主要以斑马鱼为例, 介绍了整胚原位杂交技术的发展历史, 并重点介绍了本实验室所用的整胚原位杂交实验流程, 同时还分析了实验结果不理想的原因及其解决方法。     

Connexin43基因抑制对斑马鱼心血管系统发育的影响

为了研究cx43基因抑制对斑马鱼胚胎心血管系统发育的影响,针对cx43的翻译起始位点设计两个吗啉修饰的反义寡核苷酸抑制其表达,在斑弓鱼受精卵一到两细胞期混合注射并且验证其有效性.注射后用原位杂交和原位免疫荧光检测心脏标志基因的表达以及心脏的表型,同时利用显微荧光造影和原位杂交检测血管的发育情况.用心室心房的标志基因vmhc和amhc反义RNA探针进行的原位杂交结果显示,vmhc表达抑制,而amhc表达上调.原位免疫荧光显示与原位杂交一致的结果表明:心房扩张心室缩小,并且心脏环化不全.用血管标志基凶flk-1的RNA探针原位杂交和显微荧光造影表明,cx43基因抑制的斑马鱼胚胎血管无明显缺陷.此外,cx43基因抑制的斑马鱼胚胎心脏功能也有明显改变,包括心脏搏动无力,有血液回流现象.抑制cx43的表达可能通过影响两个细胞群的迁移导致斑马鱼胚胎心脏的发育缺陷,从而影响了心脏的功能,但是未发现胚胎血管系统发育的明显缺陷.     

应用小鼠整体原位杂交技术检测MDM2在鼠胚发育不同阶段的表达

整体原位杂交(whole-mountinsituhybridization,WMH)已经成为基因表达定位和表达分布模式研究的一种重要手段.该技术能在整体水平上精确地研究胚胎发育过程中基因表达的三维信息,而且为大规模筛选区域及组织特异性候选克隆提供了有利的技术手段.采用体外转录地高辛标记的RNA探针,检测已知基因MDM2在鼠胚胎发育不同阶段的表达模式.