一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini-F replicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内,构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid-HZ8).另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和 P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒.利用HapFastBacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上,随后将含有eGFP基因的重组HaBacmid DNA转染至HZAm1细胞内.转染5d后,细胞核内能形成典型的多角体,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光.结果证明我们构建的HaBac to Bcac 表达系统能有效的表达外源基因.     

一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini Freplicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因 8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内 ,构建了既能在E .coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代 pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列 ,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒。利用HapFastBacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上 ,随后将含有eGFP基因的重组HaBacmidDNA转染至HZAm1细胞内。转染 5d后 ,细胞核内能形成典型的多角体 ,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。结果证明我们构建的HaBactoBcac表达系统能有效的表达外源基因     

中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒多角体蛋白基因的序列分析

以AcMNPV的多角体蛋白基因为探针,定位了中国棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HaSNPV）的多用体蛋白基因。序列测定表明,HaSNPV的多角体蛋白基因编码区为738个核苷酸,编码246个氨基酸,预计蛋白质分子量为29kDa。同源性分析表明,HaSNPV与美洲棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HzSNPV）具有最高的同源性,在整个阅读框架中只有4个碱基的差异,其中第179位碱基的变化导致唯一的氨基酸变化,这种变化并未导致其二级结构的改变。此外,两种病毒该基因的启动子结构也完全一样。HaSNPV与其它的SNPV和MNPV的同源性明显要低。结果预示HaSNPV与HzSNPV可能为同种病毒的不同变种。     

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因及杆状病毒 几丁质酶基因的分子进化

用PCR方法扩增了棉铃虫Helicoverpa armigera单粒包埋型核型多角体病毒（HaSNPV）几丁质酶基因,测定了基因编码区的核苷酸全序列。基因编码区全长1.713 bp,可编码570个氨基酸残基组成的多肽,预计分子量为63.6 kD。将所推导的HaSNPV几丁质酶氨基酸序列与其它已知杆状病毒几丁质酶氨基酸序列进行联配比较,结果表明HaSNPV 与谷实夜蛾H.zea单粒包埋型核型多角体病毒（HzSNPV）的氨基酸序列非常相似,同源性高达90.7%,与苜蓿丫纹夜蛾Autographa californica多粒包埋型核型多角体病毒（AcMNPV）、家蚕Bombyx mori核型多角体病毒（BmNPV）、美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒（HcNPV）、舞毒蛾Lymantria dispar多粒包埋型核型多角体病毒（LdMNPV）、黄杉毒蛾Orgyia pseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒（OpMNPV）和云杉卷叶蛾Choristoneura fumiferana核型多角体病毒（CfMNPV）氨基酸序列同源性分别为64.4%、64.9%、64.2%、62.9%、66.2%和61.5%。根据氨基酸序列用PC＼GENE程序绘制已知杆状病毒几丁质酶的分子系统树,并与杆状病毒中最为保守的多角体蛋白基因系统树作了比较,结果表明几丁质酶基因和多角体蛋白基因的进化速率是不尽相同的。     

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整

P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一。本文通过构建p10缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能。利用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒(HaSNPV)细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因,然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上,构建了p10缺失的重组HaBacΔp10-PH-eGFP。重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明,缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响,但电镜观察结果显示,P10的缺失会影响多角体囊膜的包装。     

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整

P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一.本文通过构建p10 缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能.利用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒(HaSNPV)细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因, 然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上, 构建了p10缺失的重组HaBacΔp10- PH-eGFP.重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明,缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响,但电镜观察结果显示,P10的缺失会影响多角体囊膜的包装.     

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV)复制的研究——Ⅰ.细胞病理学和病毒复制的一些特性

本文报道了棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(Heliothis armigera single nucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, HaSNPV)在棉铃虫及棉铃虫蛹卵巢细胞系SFE-HA-8212中的复制。HaSNPV的复制和其他的核型多角体病毒大体相符,复制过程也可分为形成出芽型病毒与形成包埋型病毒这两个时相。研究了影响病毒在细胞中复制的诸因素,包括病毒感染复数、细胞接种密度和细胞生长阶段等。在适宜的条件下平均每细胞可生产出芽型病毒14PFU,多角体24个。生成的病毒具有感染力。这些表明SFE-HA-8212细胞可供HaSNPV有效复制。同时,作为细胞群体该细胞系对HaSNPV感染的反应并非均一,其中有89.65±21.4％的感染细胞释放病毒,但仅有37.85±6.7％的细胞形成多角体。表明HaSNPV的感染并不一定导致形成多角体,在大部分感染细胞中病毒复制进行到产生病毒粒子就停止了。初步讨论了这种不均一性的原因。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)Hind Ⅲ-L片段的序列分析

本文报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)基因组的HindⅢ-L片段的全序列.该片段全长2 635bp,包括5个有意义的开放阅读框HaSNPV ORF227,晚期表达因子10基因(lef10),vp1054基因,Ac55(AcMNPV ORF55的同源基因),Ac56(AcMNPV ORF56的同源基因).与其它6种杆状病毒的氨基酸序列比较表明,HaSNPV的lef10基因与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeMNPV)的同源性最高,为64%,与冷杉毒蛾核型多角体病毒(OpMNPV)的同源性最低,为43%;HaSNPV的vp1054基因与SeMNPV的同源性最高,为65%,与OpMNPV的同源性最低,为49%.序列比较表明,HaSNPV的LEF10与VP1054蛋白与其它6种杆状病毒具有相同的保守区和亮氨酸拉链(1eucine zipper)     

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒极早期基因(ie-1)分析(英文)

克隆了棉铃虫Helicoverpaarmigera单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)C1株基因组DNA ,并通过随机测序的方法测定了经XbaI酶切后的H片段的核苷酸全序列。序列比较和分析发现该片段中ORF1 3与苜蓿丫纹夜蛾Autographacalifornica多粒包埋型核型多角体病毒 (AcMNPV)基因组ORF1 47(ie 1 )同源。ie 1基因编码区全长 1 986bp ,根据推测的氨基酸序列 ,可编码 6 6 1个氨基酸残基组成的多肽 ,预计分子量为 76 .5kD。将所推导的HaSNPVIE 1氨基酸序列与其它已知的杆状病毒IE 1氨基酸序列进行比较 ,结果表明 ,HaSNPV和谷实夜蛾H .zea单粒包埋型核型多角体病毒IE 1氨基酸序列最为相似 ,同源性高达 98%。与AcMNPV、家蚕Bombyxmori核型多角体病毒 (BmNPV)、云杉卷叶蛾Choristoneurafu miferana多粒包埋型核型多角体病毒 (CfMNPV)、舞毒蛾Lymantriadispar多粒包埋型核型多角体病毒(LdMNPV)、黄杉毒蛾Orgyiapseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒 (OpMNPV)、甜菜夜蛾Spodopteraex igua多粒包埋型核型多角体病毒 (SeMNPV)、小菜蛾Plutellaxylostella颗粒体病毒 (PxGV)和Xestiac ni grum颗粒体病毒 (XcGV)的IE 1氨基酸序列同源性较低 ,分别为 2 3 %、2 3 %、2 3 %、2 5 %、2 3 %、1 4%、2 7%和 7%。根据氨基酸序列由GENETYX     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（HaSNPV）Hind Ⅲ—L片段的序列分析

本文报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV）基因组的HindⅢ－L片段的全序列。该片段全长2635bp,包括5个有意义的开放阅读框：HaSNPV ORF227,晚期表达因子10基因（lef10 ),vp1054基因,Ac55(AcMNPV ORF55的同源基因）,Ac56（AcMNPV ORF56的同源基因）。与其它6种杆状病毒的氨基酸序列比较表明,HaSNPV的lef10基因与甜夜蛾核型多角体病毒（SeMNPV）的同源性最高。为64％,与冷杉毒蛾核型多角体病毒（OpMNPV）的同源性最低,为43％;HaSNPV的vp1054基因与SeMNPV的同源性最高。为65％,与OpMNPV的同源性最低,为49％。序列比较表明,HaSNPV的LEF10与VP1054蛋白与其它6种杆状病毒具有相同的保守区和亮氨酸拉链（leucine zipper）。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)Hind III-L片段的序列分析

本文报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒 (Helicoverpaarmigerasingle nucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)基因组的HindIII L片段的全序列。该片段全长 2 6 35bp ,包括 5个有意义的开放阅读框 :HaSNPVORF2 2 7,晚期表达因子 10基因 (lef10 ) ,vp10 5 4基因 ,Ac5 5 (AcMNPVORF5 5的同源基因 ) ,Ac5 6 (AcMNPVORF5 6的同源基因 )。与其它 6种杆状病毒的氨基酸序列比较表明 ,HaSNPV的lef10基因与甜菜夜蛾核型多角体病毒 (SeMNPV)的同源性最高 ,为6 4 % ,与冷杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)的同源性最低 ,为 4 3% ;HaSNPV的vp10 5 4基因与SeMNPV的同源性最高 ,为 6 5 % ,与OpMNPV的同源性最低 ,为 4 9%。序列比较表明 ,HaSNPV的LEF10与VP10 5 4蛋白与其它 6种杆状病毒具有相同的保守区和亮氨酸拉链 (leucinezipper)     

棉铃虫核多角体病毒p10基因的序列及转录分析

为了利用棉铃虫核多角体病毒（HaSNPV）p10基因的启动子构建重组病毒杀虫剂及表达系统,应用末端测序法和引物步移法测定了p10基因的序列,并应用Northern杂交和引物延伸实验对该基因进行了深入的转录特性分析,HaSNPV p10基因被定位于基因组DNA的115.4kb-115.6kb处,转录方向与多角体基因相反,在其上下游分别发现了p26和p74基因。转录分析结果确定了p10基因是个极晚期基因,其转录从杆状病毒晚期转录保守序列GTAAG的第二个A开始,转录产物大小约为430nt。HaSNPV p10基因最早可检测到的转录是在病毒感染后的20h,随后其转录产物量迅速放大,到感染后72h达到非常高的水平。围康时相分析同时还检测到一个大小为1300nt的产物,推测该产物为p26和p10通读的转录产物。对HaSNPV P10蛋白序列的分析表明,该蛋白第6－44位及第51－65位氨基酸序列处含多个典型的卷曲螺旋七聚体重复结构,两片段间相隔6个氨基酸残基,在该蛋白序列的第20－34位与第51－65位存在L－X（2）－L－X（10）－L的亮氨酸重复。Helical net分析表明,HaSNPV P10的疏水氨式酸分布为两个集簇区,两者互为180度转角。     

四种杆状病毒血清学关系的研究

血清学性质可作为病毒分类鉴定的依据,为此作者提纯芹菜夜蛾核多角体病毒-D克隆株（SfaMNPV-D)与棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒（HaSNPV),斜纹夜蛾核型多角体病毒（SLMNPV）,粉蚊夜蛾颗粒体病毒（TnGV)等四种杆状病毒的病毒粒子和多角体蛋白（颗粒体蛋白）作为抗原免疫家兔后制取抗血清,经1%琼脂糖免疫电泳,结果发现多角体病毒之间血清关系比与颗粒病毒血清学关系更密切。     

棉铃虫核型多角体病毒朝鲜分离株的初步研究

为了充分利用棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera,HaSNPV)资源,为开展害虫生物防治提供依据,对首次在朝鲜分离到的棉铃虫核型多角体病毒进行了研究。本文从形态结构,结构多肽。核酸限制性内切酶图谱等方面进行了研究。多角体直径0.36-1.3μm,平均1.02μm,病毒粒子大小为326 nm×69nm。经SDS-PAGE分析,棉铃虫核型多角体朝鲜株多角体蛋白为一条带。多角体蛋白分子量为28.7kDa。棉铃虫核型多角体朝鲜株基因组经BamH Ⅰ,EcoR Ⅰ,HindⅢ和Pst Ⅰ消化后,得到的内切酶图谱表现,与已报道的几个分离株比较类似。分子大小均为130.18kb。     

棉铃虫核型多角体病毒朝鲜分离株的初步研究

为了充分利用棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera,HaSNPV)资源,为开展害虫生物防治提供依据,对首次在朝鲜分离到的棉铃虫核型多角体病毒进行了研究.本文从形态结构,结构多肽.核酸限制性内切酶图谱等方面进行了研究.多角体直径0.36-1.3 μm,平均1.02μm,病毒粒子大小为326 nm×69nm.经SDS-PAGE分析,棉铃虫核型多角体朝鲜株多角体蛋白为一条带.多角体蛋白分子量为28.7kDa.棉铃虫核型多角体朝鲜株基因组经BamH I,EcoR I,HindⅢ和Pst I消化后,得到的内切酶图谱表现,与已报道的几个分离株比较类似.分子大小均为130.18kb.     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒组织蛋白酶基因的序列分析和进化研究

对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)的组织蛋白酶(ν-cath)基因进行了序列分析,此基因编码区长1098bp,预计编码一个366个氨基酸的蛋白产物.序列分析表明,HaSNPV的V-CATH蛋白与其它杆状病毒的同源蛋白具有相似的保守结构并保留有相同的酶活性位点,根据已知的杆状病毒组织蛋白酶序列构建了ν-cath基因的进化树,发现HaSNPV的ν-cath位于NPV组中一个单独的分枝,结合ν-cath基因在棉铃虫病毒基因组中的位置与其它NPV有较大不同,推测HaSNPV的ν-cath基因可能拥有特殊的进化历程.     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒组织蛋白酶基因的序列分析和进化研究

对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（HaSNPV)的组织蛋白酶（v-cath）基因进行了序列分析,此基因编码区长1098bp,预防编码一个366个氨基酸的蛋白产物,序列分析表明,HaSNPV的V－CATH蛋白与共它杆状病毒的同源蛋白具有相似的保守结构并保留有相同的酶活性位点,根据已知的杆状病毒组织蛋白酶序列构建了v-cath基因的进化树,发现HaSNPV的v-cath位于NPV组中一个单独的分枝,结合v-cath基因在棉铃虫病毒基因组中的位置与其它NPV有较大不同,推测HaSNPV的v-cath基因可能拥有特殊的进化历程。     

创建可视化的家蚕杆状病毒表达系统表达家蚕二分浓核病毒非结构蛋白NS1

重组杆状病毒感染昆虫细胞是表达外源蛋白常用的一种方法。为有效鉴定转染的细胞中是否产生了重组病毒粒子,对质粒pFastBacI进行改造,构建了极早期基因ie1启动子控制的绿色荧光蛋白egfp基因表达盒,以及多角体基因启动子控制的外源DNA的一个通用型双表达载体;通过酶切、连接的方式,将家蚕二分浓核病毒ns1基因连接到多角体启动子下游;在转座酶的介导下,该供体质粒上部分序列可转座到穿梭载体Bm-Bacmid上,进而构建可同时表达egfp和ns1基因的重组杆粒。将构建的该重组杆粒DNA转染BmN细胞,通过观察可视化的绿色荧光信号,可迅速判定转染后的细胞中重组病毒粒子产生的情况,收集转染后的细胞培养上清,将其感染BmN细胞,对感染4 d后的细胞总蛋白进行Western blotting分析,结果表明能杂交到一条36 kDa大小的特异蛋白,表明NS1蛋白成功获得了表达,进而为深入研究ns1基因的功能奠定了基础。     

棉铃虫核型多角体病毒sod基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从棉铃虫(Helicoverpa armigera)单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV) C1株基因组中扩增sod基因编码区,克隆到pGEM-T-easy vector,测定了核苷酸序列.将基因编码区克隆到原核表达载体pETblue2,构建了含表达质粒pETblue2/HaSNPV SOD,转化大肠杆菌DE3(BL21)进行IPTG诱导表达. SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细胞总蛋白的37%.邻苯三酚法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物校正酶活力单位为694U/mg.     

中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒（HaSNPV）HindⅢ-Ⅰ片段的序列分析与基因排列研究

对中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒（HaSNPV)基因组中的HindⅢ-Ⅰ片段的序列进行分析,该片段全长7501nt,包括10个开放阅读框：AcMNPV ORF111的同源基因（Ac 111),晚期表达因子2（lef-2）基因,病毒核壳结构蛋白p24基因、gp16基因、多角体包膜蛋白（polyhedron envelope protein,pep)基因、AcMNPV ORF63的同源基因（Ac63),38.7kD基因,晚期表达因子1（lef-1) 基因,及两个特有基因HaSNPV orf591和HasSNPV orf435。基因组的排列比较分析发现与AcMNPV有较大区别。