四唑盐减低法结合激光共聚焦显微镜定量分析表皮葡萄球菌生物被膜体外模型

目的建立体外表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)生物膜(biofilm,BF)模型,观察和定量分析表皮葡萄球菌BF的动态形成过程。方法采用可形成BF的表皮葡萄球菌RP62A,平板法建立体外BF模型,四唑盐(tetrazolium salt,XTT)减低法定量检测BF形成过程中细菌活力的变化,激光共聚焦显微镜(confocal laser scan-ning microscopy,CLSM)结合图像结构分析软件(image structure analyer,ISA)对BF形成过程结构参数进行动态分析,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察BF形成过程中的形态结构。结果在12、24和48 h时,XTT减低法A450的值分别为2.39±0.48、3.41±0.18和3.92±0.27,P0.05;ISA软件定量分析显示在区域孔径(AP)的值分别为0.84±0.08、0.68±0.01和0.59±0.13,P0.05,平均扩散距离(ADD)的值分别为1.34±0.24、1.49±0.09和1.89±0.39,P0.05,结构熵(TE)的值分别为4.71±0.82、8.69±0.68和8.94±0.28,24 h、48 h与12 h相比,P0.05。结论表皮葡萄球菌BF的形成是个动态的过程,24 h时BF基本形成,48 h BF结构更加复杂。XTT减低法,CLSM结合ISA软件,SEM三种方法联合使用是观察和定量分析体外BF模型较理想的方法。     

纳米银离子对铜绿假单胞菌生物被膜结构的影响的分析

目的探讨纳米银离子对细菌生物被膜（biofilm,BF）的空间结构的影响。方法采用摇床法,以纳米银离子含量不同的乙烯-醋酸乙烯酯（Ethylene-Vinyl acetate,EVA）塑料为细菌粘附载体,模拟体内铜绿假单胞菌（P.aeruginosa,PA）BF形成的微环境,建立体外BF模型;将培养3 d的空白标本分别在扫描电子显微镜（scanning electron microscopy,SEM）下及用FITC-ConA染色后荧光显微镜下观察不含纳米银EVA中BF的形成情况;将生长0.5、1、2、3、5 d的BF模型行SYTO9/PI染色,激光共聚焦扫描电镜（confocal laser scanning microscopy,CLSM）下摄取不同层面的图像,然后应用激光共聚焦显微镜TCS SP2自身具有的分析软件及ISA分析软件获得PAO1菌株BF的相关空间结构参数定量化数据。结果 （1）运用SEM及荧光显微镜的方法,在以不含纳米银EVA塑料为细菌粘附载体上培养3 d的标本中均观察到流线状的BF形成。（2）激光共聚焦显微镜TCS SP2自身具有的分析软件定量化分析显示,随着时间的延长,各含纳米银离子材料组PAO1菌株BF的平均厚度都呈先升高后降低的趋势,3天组都达最高值;纳米银离子的含量对BF厚度的影响差异无统计学意义（F=2.11,P＆gt;0.1）,作用时间对BF厚度的影响差异有统计学意义（F=985.81,P0.05）。随着培养时间的延长,各含纳米银离子材料组PAO1菌株BF的AP值、ADD值无明显的变化趋势,同一时间组的含有纳米银离子材料组PAO1菌株BF的AP值都高于空白对照组的AP值;同一时间组的含有纳米银离子材料组PAO1菌株BF的ADD值都低于空白对照组的ADD值。各含纳米银离子材料组PAO1菌株BF的TE值随着时间的延长,都呈先升高后降低的趋势,2天组都为最高值;同一时间组的TE值随着含纳米银离子的增加都呈降低趋势。结论运用摇床法成功建立了体外PAO1菌株BF模型;纳米银离子对PAO1菌株BF空间结构有显著的影响。     

青蒿琥酯对铜绿假单胞菌生物膜形成及结构的影响

建立体外铜绿假单胞菌生物膜(biofilm BF)模型,探讨青蒿琥酯(artesunate)对生物膜的影响。分光光度法测定青蒿琥酯对铜绿假单胞菌浮游菌生长的影响。选取铜绿假单胞菌野生株(PAO1)建立生物膜模型,设立对照组、青蒿琥酯组、环丙沙星(ciprofloxacin)组。结晶紫染色后测定570 nm波长光密度值,以观察6 h时细菌粘附情况;建模3 d后经不同浓度的青蒿琥酯或环丙沙星处理后利用平板稀释计数法计算活菌数;利用激光扫描共聚焦显微镜成像技术(confocal laser scanning microscopy,CLSM)结合生物膜定量分析软件COMSTAT对生物膜的单位面积生物量、平均厚度、粗糙系数、平均扩散距离进行定量分析。研究显示青蒿琥酯对铜绿假单胞菌浮游菌无明显抑制作用。建模3 d后,生物膜经不同浓度的青蒿琥酯干预12 h后,512μg/m L、1 024μg/m L组生物膜内的活菌数分别为(6.99±0.21)、(6.45±0.19)log10 CFU/m L,与对照组相比,差异有统计学意义(p0.05)。青蒿琥酯组(512μg/m L)和环丙沙星组在6 h时细菌粘附性显著下降,与对照组相比有统计学差异(p0.05)。与对照组相比,经青蒿琥酯和环丙沙星处理后生物膜生物量、平均厚度以及平均扩散距离等结构指标数值都有明显减少(p0.05);青蒿琥酯组粗糙系数增加(p0.05),环丙沙星组粗糙系数无明显变化(p0.05),但这两组的粗糙系数对比有统计学差异(p0.05)。该研究表明青蒿琥酯能够降低铜绿假单胞菌粘附性及破坏成熟生物膜结构。     

大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及结构定量化分析

目的利用激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）观察大蒜素对铜绿假单胞菌PA01菌株生物膜（biofilms,BF）形成过程的影响,并用ISA（Image Structure Analyzer）软件对BF结构进行定量化分析。方法体外建立1d．3d和7d组PA01菌株BF模型,每组分3小组,分别用生理盐水、大蒜素128μg／mL、大蒜素10μg／mL作用6h。通过荧光探针SYT09／PI标记,利用CLSM进行动态观察,并用ISA软件对其BF结构进行定量分析。结果（1）生理盐水对照组铜绿假单胞菌生物膜厚度随时间的增加而增加,但在后3d增加的速度减慢;同时区域孔率（Areal Porosity,AP）呈下降趋势,平均扩散距离（Average Diffusion Distance,ADD）有逐渐增加趋势,结构熵（Textural Entropy,TE）有增加的趋势。（2）7d组模型中,大蒜素128μg／mL作用后,BF厚度由（28．83±0．67）μm减低到（16．50±0．69）μm;AP由0．76±0．10增加到0．92±0．02;TE由6．78±0．93减低到5．61±0．55。10μg／mL大蒜素干预后,有同样趋势,但效应不如高浓度明显。（3）1d、3d模型组,大蒜素作用后同对照组相比,厚度、AP、TE的差异均有统计学意义,趋势同7d组。结论通过ISA软件对干预前后的BF进行结构定量分析,大蒜素对各个时间段BF的形成均有影响,高浓度效果更显著。     

镁离子对黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成过程的影响

目的探讨镁离子对黏液型铜绿假单胞菌早期黏附和生物膜形成过程的影响。方法荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点96孔板底部黏附细菌的荧光强度,荧光探针FTTC-ConA染细菌胞外多糖（Extracellular Polymeric Substances,EPS）、荧光显微镜下观察各组多糖差别;SYTO9／PI染生物膜内细菌、激光共聚焦显微镜观察结合BF图像结构分析软件（Image Structor Analyzer,ISA）对各组生物膜结构参数进行定量分析。结果2d时,空白组和1mmol／L镁组的黏附细菌的荧光强度分别为1845．67±45．3和2254．78±42．45,t=-9．96,P〈0．05;0．1mmol／L的镁浓度下荧光强度也有增加,其余各时间组趋势与2d组相似;在荧光显微镜下观察可见随着镁浓度增加,EPS增多;激光共聚焦显微镜下可见随着镁浓度增加,生物膜活菌增加、菌落变密集;ISA软件分析结果示：空白组和1mmol／L镁组的6d生物膜厚度分别为（25．80±1．16）μm和（34．87±1．59）μm,t=-13．85,P〈0．05;区域孔率分别为0．96±0．05和0．90±0．04,t=2．48,P〈0．05;平均扩散距离分别为1．54±0．15和1．92±0．16,t=5．23,P〈0．05;结构熵分别为3．64±0．57和4．70±1．09,t=-2．6,P〈0．05,3d组生物膜也有相同的趋势。结论镁离子可以增强黏液型铜绿假单胞菌的早期黏附,影响随后生物膜的形成及结构。     

野生型铜绿假单胞菌和新型mucA突变铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察

目的观察新型mucA突变的粘液型菌株PA17和野生型菌株PAO1生物膜(biofilm,BF)形成的动态过程,并比较2株菌生物膜形成过程的差异。方法 SYTO9/PI荧光探针标记PAO1和PA17,体外建立1d,3d,5d,9d时间点PAO1及PA17的BF模型,激光共聚焦显微镜(CLSM)观察两株菌BF动态形成的过程。结果通过SYTO9/PI双染可以动态观察PAO1菌株和PA17菌株的BF形成过程;PAO1菌株和PA17菌株的BF形成过程有差异:PAO1菌株1d时已形成微菌落,3d时形成覆盖整个玻片的生物膜结构,而PA17菌株1d时仅有散在的不可逆粘附细菌,3d时才形成微菌落,5d时形成生物膜结构;随着时间的推移,2株菌生物膜形成的厚度均逐渐增加,且死菌的比例也逐渐增加。结论 PAO1和PA17BF的动态形成过程存在差异,而PA17与PAO1生物膜形成存在的差异可能与其mucA基因突变造成大量藻酸盐的产生有关。     

Zn2+ 螯合剂DTPA（二乙基三胺五乙酸）对人工关节假体感染后表皮 葡萄球菌生物膜形成及相关基因表达的影响

目的:探讨DTPA对人工关节假体(prosthetic joints infection,PJI)感染后表皮葡萄球菌生物膜形成及所需基因聚集相关蛋白(AAP)基因表达的影响。方法:构建新西兰大白兔假体感染表皮葡萄球菌生物膜模型,随机分为实验组(n=25)和对照组(n=25),对照组只注射细菌,实验组在注入细菌的同时,注射DTPA,分别于注射后第2、4、6、8、16天灌洗、收集膝关节液,采用RT-PCR方法检测不同时间点目的基因AAP基因表达的变化。对不同时间点的假体感染动物行膝关节假体扫描电镜和假体周围组织学观察。结果:DTPA可以显著抑制AAP基因的表达,扫描电镜观察第2、4、6、8、16天实验组较对照组假体表面粘附表皮葡萄球菌明显减少(P<0.05),生物膜明显受抑制。实验组假体周围组织炎性反应较对照组明显减轻。结论:DTPA可以抑制表皮葡萄球菌生物膜形成中相关蛋白AAP基因的表达,可能抑制生物膜的形成。     

不同植入材料对表皮葡萄球菌和结核杆菌粘附和生物膜形成的影响

目的:探讨表皮葡萄球菌和结核杆菌在不同生物材料表面粘附性和生物膜形成能力的差异,为临床骨科材料的选择提供理论参考。方法:采用常规方法进行细菌分离和菌种鉴定。粘附能力检测采用菌落计数法,生物膜形成能力检测采用96孔板结晶紫染色法。结果:结核杆菌和表皮葡萄球菌在骨组织均有最强的粘附和生物膜形成能力,表皮葡萄球菌在三种材料上的粘附和生物膜形成能力均高于结核杆菌,表皮葡萄球菌和结核杆菌在铁合金和不锈钢粗糙表面上的粘附和生物膜形成能力均显著高于其光滑表面(P0.05)。结论:表皮葡萄球菌和结核杆菌在不同生物材料上具有不同的粘附和生物膜形成能力,不同种属细菌在不同材料的粘附和生物膜形成能力为临床骨科生物材料的选择提供了理论依据。     

白色念珠菌生物膜体外模型的建立及不同检测方法比较

目的建立白色念珠菌生物膜体外模型,为进一步研究白色念珠菌生物膜的耐药机制及干预提供基础。方法平板法培养白色念珠菌生物膜,利用扫描电镜、激光共聚焦显微镜和荧光显微镜等多种检测方法观察生物膜形成情况。结果白色念珠菌能够在玻片上形成典型的生物膜,通过荧光显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜下观察白色念珠菌随着时间增加逐渐增加,48 h形成初步生物膜,72 h结构更加复杂和成熟。ISA软件定量化分析显示,SYTO9/PI荧光探针标记的生物膜模型的区域孔径(AP)在24、48和72 h分别为0.95±0.06、0.89±0.01和0.83±0.01,平均扩散距离(ADD)分别为1.16±0.13、1.26±0.06和2.43±0.76,结构熵(TE)分别为4.87±0.34、5.18±0.35和5.47±0.16,两两比较,差异均有统计学意义(P0.05)。Im age-Pro P lus 6.0软件分析显示,生物膜内真菌死亡率分别为(34.71±2.72)%、(36.63±4.20)%和(47.41±2.53)%,与24 h及48 h相比,72 h真菌死亡率增加差异具有统计学意义(P0.05)。结论平板法能够较好地建立白色念珠菌生物膜体外模型,并可利用多种方式检测。     

金诺芬对表皮葡萄球菌及其生物膜的影响

目的研究金诺芬对表皮葡萄球菌及其生物膜的作用。方法利用微量稀释法药敏试验检测金诺芬对表皮葡萄球菌浮游菌生长的影响,并利用结晶紫染色和激光共聚焦显微镜观察金诺芬对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。结果金诺芬对表皮葡萄球菌的MIC和MBC分别为0.125～0.250μg/mL和2.000～4.000μg/mL。同时,4μg/mL金诺芬还能显著抑制表皮葡萄球菌标准菌株和临床菌株生物膜的形成(P0.05)。通过激光共聚焦显微镜观察发现金诺芬能有效抑制生物膜的形成,降低生物膜的聚集,并增加死亡细菌的比例。结论金诺芬能显著抑制表皮葡萄球菌浮游菌的增殖和生物膜的形成。     

穿心莲内酯等中药有效成分对表皮葡萄球菌生物膜渗透性的比较

目的比较穿心莲内酯、大黄素、盐酸小檗碱等对表皮葡萄球菌生物膜的渗透性,为中药治疗表皮葡萄球菌引起的相关感染提供相关研究的依据。方法在体外建立SE—BF（表皮葡萄球菌生物膜模型）和PB（生物膜渗透模型）,观察穿心莲内酯、大黄素、盐酸小檗碱等中药有效成分对PB的渗透率。结果大黄素、穿心莲内酯36h渗透率分别达到88．00％、82．89％,而盐酸小檗碱渗透率在几种药物中相对较差。结论中药有效成分对表皮葡萄球菌生物膜有较强的渗透性。     

连翘苷和黄芩苷对表皮葡萄球菌生物膜抑制作用的研究

目的通过中药有效成分连翘苷和黄芩苷分别对表皮葡萄球菌生物膜抑制作用的研究,为表皮葡萄球菌生物膜引起的相关感染提供新的治疗途径。方法体外构建表皮葡萄球菌生物膜,XTT减低法评价连翘苷、黄芩苷对表皮葡萄球菌初始黏附及生物膜内细菌代谢的影响,显微镜下观察用药后表皮葡萄球菌生物膜形态和结构改变。结果连翘苷和黄芩苷对表皮葡萄球菌生物膜的早期黏附均无抑制作用;连翘苷对表皮葡萄球菌生物膜菌的SMIC50为31.25μg/ml,而黄芩苷对表皮葡萄球菌生物膜菌的代谢无影响;在显微镜下观察,连翘苷使部分表皮葡萄球菌被膜的形态发生改变,而黄芩苷对其形态影响不显著。结论连翘苷对表皮葡萄球菌生物膜的初始黏附阶段无抑制作用,对生物膜菌的代谢和生物膜形态均有显著影响;黄芩苷对表皮葡萄球菌生物膜无显著作用。     

十二烷基苯磺酸钠对引发内置物感染表皮葡萄球菌生物被膜的作用

【背景】随着医用内置物的广泛使用,由表皮葡萄球菌生物被膜导致的医院获得性感染不断增多,目前鲜见关于表面活性剂针对表皮葡萄球菌生物被膜作用的报道。【目的】通过研究阴离子型表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(sodium dodecyl benzene sulfonate,SDBS)分别对ATCC 35984 (产膜表皮葡萄球菌标准株)生物被膜的清除、生物被膜内细菌代谢和形成生物被膜的关键物质多糖胞间黏附素(polysaccharide intercellular adhesion,PIA)产生的影响,为临床使用SDBS防治由表皮葡萄球菌生物被膜引起的相关感染提供可靠的理论及实践依据。【方法】利用XTT减低法,评价SDBS对ATCC 35984已形成生物被膜的清除效率及对生物被膜内细菌代谢的影响;激光共聚焦显微镜观察SDBS对生物被膜作用的效果;采用刚果红培养基观察SDBS对PIA产生的影响。【结果】浓度为256、128、64、32、16 mg/L的SDBS在作用6、12、24 h时,对ATCC 35984的生物被膜均有显著的清除效率(P<0.01);浓度为32 mg/L时对生物被膜内细菌的...     

Lack of biofilm contribution to bacterial colonisation in an experimental model of foreign body infection by Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis

The contribution of in vivo biofilm-forming potential of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis was studied in an experimental model of foreign body infections. Increasing inocula (from 10(2) to 10(7) organisms) of ica-positive strains of S. aureus and S. epidermidis and their ica-negative isogenic mutants (the ica locus codes for a major polysaccharide component of biofilm) were injected into subcutaneously implanted tissue cages in guinea pigs. Surprisingly, bacterial counts and time-course of tissue cage infection by ica-positive strains of S. aureus or S. epidermidis were equivalent to those of their respective ica-negative mutants, in the locally infected fluids and on tissue-cage-inserted plastic coverslips.     

Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis carrying biofilm formation genes: detection of clinical isolates by multiplex PCR

Staphylococcus epidermidis is the most prevalent coagulase-negative Staphylococcus (CNS) and is a major cause of hospital bacteremia. Based on 18 reference strains and 149 Staphylococcus clinical strains, used in a novel multiplex PCR method, the aim of this study was to identify S. epidermidis with respect to the sequence of three genes: recN, which encodes a recombination/repair protein, mecA (methicillin resistance), and icaAB, which is involved in biofilm formation. Amplicons of 219 bp (S. epidermidis-recN gene), 154 bp (mecA gene), and 546 bp (icaAB genes) were obtained. Reliable results were achieved for 100% of the evaluated strains, suggesting that this new multiplex-PCR approach could be useful for the accurate identification of methicillin-resistant S. epidermidis with the potential to produce biofilm.     

Induction of Staphylococcus epidermidis biofilm formation via proteolytic processing of the accumulation-associated protein by staphylococcal and host proteases

Because of its biofilm forming potential Staphylococcus epidermidis has evolved as a leading cause of device-related infections. The polysaccharide intercellular adhesin (PIA) is significantly involved in biofilm accumulation. However, infections because of PIA-negative strains are not uncommon, suggesting the existence of PIA-independent biofilm accumulation mechanisms. Here we found that biofilm formation in the clinically significant S. epidermidis 5179 depended on the expression of a truncated 140 kDa isoform of the 220 kDa accumulation-associated protein Aap. As expression of the truncated Aap isoform leads to biofilm formation in aap-negative S. epidermidis 1585, this domain mediates intercellular adhesion in a polysaccharide-independent manner. In contrast, expression of full-length Aap did not lead to a biofilm-positive phenotype. Obviously, to gain adhesive function, full-length Aap has to be proteolytically processed through staphylococcal proteases as demonstrated by inhibition of biofilm formation by alpha(2)-macroglobulin. Importantly, also exogenously added granulocyte proteases activated Aap, thereby inducing biofilm formation in S. epidermidis 5179 and four additional, independent clinical S. epidermidis strains. It is therefore reasonable to assume that in vivo effector mechanisms of the innate immunity can directly induce protein-dependent S. epidermidis cell aggregation and biofilm formation, thereby enabling the pathogen to evade clearance by phagocytes.     

Coagulase-Negative Staphylococci in Low Birth Weight Infants: Environmental Factors Affecting Biofilm Production in Staphylococcus epidermidis

Coagulase-negative staphylococci (CoNS) are the most common cause of biofilm-associated sepsis in very low birth weight infants (VLBW). Standard biofilm assays may not predict the pathogenic potential of CoNS since biofilm production is regulated by diverse environmental stimuli. Staphylococcus epidermidis isolated from blood cultures from VLBW infants were evaluated for biofilm production in response to various environmental stimuli, including intravenous solutions and skin preparations. While responses to environmental stimuli were variable for individual isolates and products, some trends were observed. Biofilm production by hospital S. epidermidis isolates (predominantly ica and biofilm-positive) was most commonly increased at 30°C and decreased in the presence of intravenous solutions and moisturisers. Commensals (mainly biofilm-negative and lacking the ica gene) were more often induced to produce biofilm than hospital isolates. These results indicate that biofilm production in S. epidermidis can vary in response to environmental stimuli encountered in the clinical setting, that standard biofilm assays are unlikely to predict clinical outcome, and that harmless skin commensals may be induced to produce biofilm by some of the products used in neonatal units.     

Influence of batch or fed-batch growth on Staphylococcus epidermidis biofilm formation

AIMS: To make a quantitative evaluation of the differences in biofilm formation by Staphylococcus epidermidis using batch and fed-batch growth systems and to correlate this with production of the major biofilm polysaccharide, poly-N-acetyl glucosamine (PNAG). METHODS AND RESULTS: Dry weight measurements of biofilms formed in batch and fed-batch conditions were compared with haemagglutination titres, which measure the amount of PNAG produced. Strains grown in batch systems developed less biofilm than when grown in fed-batch systems. A good correlation was found between the amount of biofilm formed in fed-batch systems and the haemagglutination titres. CONCLUSIONS: Differences in biofilm formation and PNAG production by S. epidermidis are dependent on the availability of nutrients, with higher availability correlating with more biofilm and PNAG production. SIGNIFICANCE OF AND IMPACT OF THE STUDY: Comparisons of the formation of biofilms by S. epidermidis are dependent on choosing an appropriate biofilm growth system. Comparability or disparity of conclusions among different investigations will be strongly influenced by which mode S. epidermidis biofilms are formed.