β淀粉样蛋白突变体的寡聚及插膜能力鉴定

β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）的插膜与寡聚是导致阿尔茨海默症（Alzheimer disease, AD）发病的重要事件。已有研究证明,Aβ氨基酸序列29～36与1～28依靠“核心疏水簇”（central hydrophobic cluster,CHC）的作用形成一个稳定的β-发夹结构,Aβ1-40/Aβ1-42的插膜与寡聚需要作用于序列37～40/37～42从而解除序列29～36与N-端之间的结合,但各基元序列如何互作从而贡献出Aβ的寡聚及插膜行为仍不清楚。本文主要研究Aβ1-28、Aβ1-36、Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ11-42、Aβ17-42等突变体的寡聚和插膜能力,并探讨各基元序列（motif）在突变体插膜与寡聚过程中的相互作用。Western印迹、硫黄素T荧光分析、透射电镜等实验检测寡聚能力,模型膜实验比较插膜能力。结果显示：与Aβ1-28及Aβ1-36相比,Aβ1-42、Aβ11-42及Aβ17-42均具有较强的寡聚及插膜能力,说明C-端序列37～42在Aβ寡聚及插膜过程中具有重要的起始作用;Aβ1-42及Aβ1-40可以形成原纤维及纤维,但Aβ11-42、Aβ17-42却不能,这显示序列1～17可以稳定纤维结构。Aβ1-28及Aβ1-36插膜及寡聚能力弱,暗示这两个突变体可能形成了不容易插膜且不容易寡聚的自身稳定结构。上述结果证明,Aβ蛋白C-端是诱导插膜与寡聚的主因,N-端可以稳定长纤维,但对插膜和寡聚的影响并不大,中间肽段很可能形成一个自身稳定的区域,这在一定程度上解释Aβ基元序列的相互作用,但具体氨基酸互作分子机制及抑制方法还需进一步研究。     

卵清溶菌酶淀粉样纤维形成的研究

淀粉样纤维与老年性痴呆症、帕金森病和非神经性组织淀粉样变性病等人类疾病相关。运用ThT荧光、刚果红结合、远紫外圆二色、透射电镜的方法研究了不同条件下卵清溶菌酶（HEWL）淀粉样纤维的形成。实验结果表明pH值2．0是HEWL淀粉样纤维形成的必要条件,HEWL淀粉样纤维的形成是一个典型的浓度依赖型过程。三氟乙醇（TFE）对HEWL淀粉样纤维形成影响结果表明中低浓度（低于40％）的TFE加速了溶菌酶淀粉样纤维的形成,其中5％～15％（v／v）的TFE促进效果最为显著,大大缩短了淀粉样纤维的成核期;而高浓度的TFE（50％）则完全抑制了溶菌酶淀粉样纤维的形成。透射电镜直接观察了溶菌酶淀粉样纤维的形态,不加TFE时溶菌酶淀粉样纤维聚集成簇,形成相互缠绕的成熟纤维,而10％的TFE存在时,观察到的形态则主要是短的原纤维,且没有发生纤维的相互交联实验。结果表明溶菌酶形成相互缠绕的成熟纤维主要由弱的疏水相互作用来驱动。     

不同寡聚形式的Aβ42与细胞膜作用显示毒性差异

β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）与神经细胞膜的相互作用是阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease, AD）发病的重要事件,但不同寡聚形式的Aβ与细胞膜相互作用的差异仍缺乏直接比较。本文通过膜天平、透射电子显微镜、Thioflavin T(ThT)和细胞毒性实验等方法,检测Aβ42单体、ADDL、原纤维等形式的β-淀粉样蛋白与磷脂膜的作用方式,分析不同形式淀粉样蛋白对细胞的毒性作用。结果显示,（1）单层膜的实验数据可以判断Aβ42单体和寡聚体插膜能力存在差异,Aβ42单体能插入磷脂单层膜内,而Aβ42 ADDL不具备插膜能力;（2）透射电镜和ThT荧光检测,定性定量地分析出不同聚集形式的Aβ42具有不同的纤维化能力,Aβ42单体纤维化能力最强,而Aβ42原纤维的纤维化能力次之,Aβ42ADDL很难形成纤维;（3）Aβ42单体细胞毒性较弱,而Aβ42 ADDL和原纤维的细胞毒性较强。由以上结果可以得出结论：在磷脂膜存在的条件下,Aβ42单体可以插入膜内并迅速形成无毒性的Aβ42纤维,因此,细胞毒性较弱。而ADDL及原纤维不能插入膜内,纤维化能力较弱,从而以寡聚体的形式发挥细胞毒性。将单体、ADDL及原纤维形式的Aβ42与细胞膜相互作用进行分析,将为Aβ42在AD中的毒性机制研究提供一定的参考。但各种寡聚体入胞的方式及毒性机制仍需要进一步研究。     

重组APP-N端蛋白与神经节苷脂GM1相互作用后的构象变化

用基因重组方法制备人类β-淀粉样蛋白前体(APP)N端融合蛋白APP_28～123,应用荧光光谱和圆二色谱技术观测GM1对APP_28～123构象的影响.结果表明：APP_28～123与GM1水溶液和含GM1的脂质体孵育后,其荧光强度明显增强,最大发射峰位蓝移20 nm;APP_28～123在溶液中的二级结构以α螺旋为主,峰位在208 nm和222 nm,而APP_28～123与PC/GM1脂质体或GM1水溶液孵育后,其二级结构虽以α螺旋为主,但摩尔椭圆度(θ)值明显增强. 以上结果表明GM1改变了APP_28～123二级结构,提示GM1引起APP分子构象的改变,可能影响APP分子正常生理功能和跨膜转运过程.     

可溶的和纤维化的Aβ1-40对膜脂的通透性的影响

利用光散射,浊度,荧光以及电镜等技术研究了可溶性的A茁1-40聚集形成纤维的动力学过程;用三种水溶性的分子质量不同的荧光探剂ANTS/DPX,Calcein,DextranFD-4包裹在脂质体内,检测可溶的和纤维化的A茁1-40对其内含物漏出的影响。结果表明:可溶性的A茁1-40在pH7.4,37℃温育4天以后开始聚集,7天后形成稳定的纤维;聚集的A茁1-40能够诱导包裹在脂质体内的ANTS/DPX,Calcein的漏出,但不能诱发Dextran(FD-4)的漏出,并初步估算出聚集的A茁1-40在膜上能产生孔径为13-18魡的小孔,而可溶的A茁1-40无此作用。这提示我们,聚集成纤维的A茁1-40能改变膜脂的物理化学性质,并造成内含物的漏出,这些作用可能是造成神经细胞毒性的重要原因。