一株聚羟基脂肪酸酯合成菌的筛选及鉴定

【背景】传统石油基塑料产品给人类和环境带来的危害日益严重,聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalknoates,PHA)作为新型可降解塑料原料越来越受到青睐。但PHA生产成本过高,使其推广应用严重受限。筛选适合大规模生产PHA的高产菌株是解决这一问题的重要途径。【目的】以挖掘合成PHA的菌种资源为目标,从极端环境筛选和鉴定新的高产PHA合成菌。【方法】通过尼罗蓝平板分离法和PCR法分离纯化菌株,采用16S rRNA基因鉴定并通过MEGA 6.0软件构建系统发育树,分析菌株的进化关系,最后通过尼罗红染色定性分析和气相色谱法定量测定该菌株在不同时期的PHA积累量。【结果】从盐碱地垃圾沉积物中分离得到了一株高产PHA的菌株,PhaC的PCR扩增结果证实了该菌株是PHA合成菌,经16S rRNA基因鉴定为Pseudomonas brassicacearum,将其命名为NP-2,进一步优化了菌株NP-2的培养条件,在培养48h时PHA积累量最大,达到3.78 mg/mL。【结论】NP-2属于Pseudomonas brassicacearum,能高产PHA。本研究为生产PHA提供了极端环境的...     

甘薯叶绿体表达载体构建及其融合基因在叶绿体中的瞬间表达

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计引物,从甘薯(Ipomoea batatas)叶绿体基因组中克隆了2个相邻的功能基因rbcL(GenBank登录号为AY942199)和accD(GenBank登录号为AY942200),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段.以来自叶绿体基因组的强启动子Prrn和RpsbA-pro分别驱动选择标记基因aadA及phaC-gfp融合基因,构建成表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter与RpsbA-pro-phaC-gfp-RpsbA-ter,然后将这2个表达盒串联在一起克隆进甘薯叶绿体同源片段中,获得甘薯叶绿体定点整合表达载体pSC-GFP.酶切分析证明,所构建的载体符合预期设计;采用该载体对甘薯叶片进行基因枪转化,结果显示,phaC-gfp融合基因可在叶绿体特异启动子和终止子的调控下在甘薯幼嫩叶片中瞬间表达,证明构建的载体pSC-GFP可用于甘薯叶绿体转化.     

Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

利用PCR和TA克隆方法扩增和克隆得到了恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S1的海藻糖合成酶基因treS.对其进行序列分析表明,其编码区含有2067bp,编码含688个氨基酸残基的蛋白质,其核苷酸序列和蛋白质序列与来源于其它假单胞菌属细菌的海藻糖合成酶的序列表现出了较高同源性.将该基因序列与表达载体pQE30T连接,构建重组质粒pQE30T-TS,并将其转化至E.coli M15菌株中.重组菌株经诱导表达后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示有明显的分子量约77.5kD的特异蛋白条带出现.经测定酶活力达19U/mL,约是原始菌株P.putida S1的50倍.     

细菌群体感应参与铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控

群体感应是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制。铜绿假单胞菌中QS系统由lasI和rhlI合成的信号分子3OC12-HSL和C4-HSL以及各自的受体蛋白LasR、RhlR组成,它们以级联方式调控多个基因表达。【目的】研究细菌群体感应(QS)对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【方法】利用铜绿假单胞菌PAO1及其QS突变株为材料通过气相色谱、荧光定量PCR在生理和分子水平上研究QS对聚羟基脂肪酸酯合成的调控。【结果】QS信号分子合成抑制剂阿奇霉素处理铜绿假单胞菌PAO1和QS突变株导致胞内PHA积累量显著减少;铜绿假单胞菌PAO1中C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210胞内PHA积累量与野生型无差别;而3OC12-HSL合成酶基因lasI缺失突变株PAO55、3OC12-HSL受体合成酶基因lasR缺失突变株PAO56以及lasI/lasR双缺失突变株PAO57胞内PHA含量与野生型相比明显减少;lasI和lasR的突变株体内PHA合成酶基因phaC1的表达量显著降低,信号分子3OC12-HSL回补实验使phaC1的表达量可恢复到野生株水平,但只可部分恢复lasI缺失导致的胞内PHA合成。【结论】由此推测,铜绿假单胞菌群体感应系统中lasI/lasR系统参与胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控。     

由细菌产生的新型生物高分子材料——具新型结构的聚羟基脂肪酸酯PHAs简介

许多微生物能产生聚－β－羟基丁酸酯（PHB）,与淀粉一样作为细胞内的能量和碳源储存物。另外在一定条件下,细菌还可积累具不同结构的单体的共聚松。由荧光假单胞菌Pseudomonas积累的PHAs的结构单元可以是多种多样的。碳链长度可在6－14之间,可由各种饱和的和不饱和的3－羟基脂肪酸组成的。P．oleovorans以正烷烃、正烷基酯或正烷醇为基质,得到的PHAs是以结构单元长度与基质相同的3－羟基脂肪酯为主要组成部分的无视共聚物。含有高达九个碳原子测链的PHAs已可由P.oleovorans利用正烷烃和脂肪酸来合成。P.oleovorans利用1－烯烃或烯酸可合成倒链具不饱和健的聚－β－羟基烷烯酯。通过改变基质中正坡泛与1－烯径的比例,PHAs的不饱和度可由0增加到50％。当以1－辛烯和1－癸烯为碳源时,所得的聚酯主要由β－羟基脂肪酯组成,而链端则是不饱和的β－羟基烷烯酯,侧链可由丙基变化到庚基。最近的研究表明,在生物合成过程中还可在PHAs的侧基上引入部分含Br、Cl、CN的苯基的官能团,或在PHAs合成过程中,可进行β－氧化形成含3－羟酰基的中间产物和再次对脂肪酸进行生物合成。P．oleovorans的这种可将官能团引入聚合物分子链中的特征．为聚合物进行剪裁提供了可能性。     

聚羟基脂肪酸酯合成酶的改造和代谢途径构建的研究进展

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是许多细菌在非平衡生长条件下在胞内积累的以颗粒状态存在的碳源和能源储藏物质。PHA因其具有生物可降解性、生物相容性等许多良好的材料性质、可以作为化学合成塑料未来的替代品而引起广泛关注。但由短链脂肪酸或单一脂肪酸单体合成的PHA的材料性质具有局限性,需要利用多种单体合成满足实际需求的PHA材料。PHA合成酶的底物特异性和PHA合成代谢途径决定着PHA的单体组成情况,进而影响着PHA的理化特性和材料性能。因此需要对PHA合成酶进行改造,扩展其对底物的特异性。另一方面需要构建新的PHA合成代谢途径,能合成出一些不常见的且性能优良的PHA材料。综述了近些年对PHA合成酶改造的研究及PHA代谢途径构建的研究进展。     

北京红篓菌聚羟基烷酸合成酶基因的克隆与表达

以北京红篓菌基因组DNA为供体,pKC505 cosmid质粒为载体系统,λ噬菌体体外包装重组质粒并转染感受态细胞E.coli JM109,构建了该菌株基因组DNA文库。以聚羟基烷酸（PHA）合成酶基因通用简并引物扩增的PHA合成酶部分基因为探针,经DIG标记后利用菌落原位杂交技术对文库进行筛选,获得3个阳性克隆菌株,PCR检测证明这3个克隆具有PHA合成酶基因片段,酶活测定表明3个克隆都具有PHA合成酶及与PHA合成相关的乙酰乙酰辅酶A还原酶的活性。     

高分子聚合物的微生物合成与降解

完成了门多萨假单胞菌和解淀粉芽胞杆菌的全基因组测序,正在采用合成生物学技术构建优势小基因组菌株;另外,基于ISO14852的检测方法提出了环境降解参数(EdK)的概念并建立了相应的检测方法。     

微生物合成中链聚羟基烷酸酯研究进展

某些微生物细胞在特定营养限制的条件下会产生聚羟基烷酸酯作为碳源储备。和短链聚羟基烷酸酯(PHB)一样 ,中链聚羟基烷酸酯由于具有更优良的性能、更高的附加值和更广泛的用途而受到人们的关注 ;此外 ,中链聚羟基烷酸酯还可以被人工合成为具有功能性侧链的半合成高聚物 ,并因此能够具有更好的弹性和更理想的结晶性能等优点 ,从而成为近年来对环境友好的生物可降解材料的研究重点。在能够合成中链聚羟基烷酸酯的微生物中 ,食油假单胞菌是最典型 ,也是研究得最多的一种。本文对由食油假单胞菌合成中链聚羟基烷酸酯的特点、代谢机制、发挥过程等内容进行了综述 ,并提出了这一研究领域未来可能的研究方向