α-氨基苄青霉素抗性转座子Tn2在E.coli K12乳糖操纵子Z基因中的插入区域特异性

转座子Tn2是大肠杆菌质粒RSF 1030上一段带有α-氨基苄青霉素抗性基因的DNA序列。这段序列具有转座能力,它能通过不同于一般的DNA重组机理从一个复制子转座到另一个复制子。已知,噬菌体Mu,插入序列IS1、IS2、IS3和抗药性转座子TnA、Tn5、Tn9、Tn10等均能使被插入的基因发生突变。已有报道,不同的转座子在E.coli K12乳糖操纵子Z基因中的插入模式不同。Mu噬菌体在Z基因     

转座因子IS10一个新的插入靶位点的序列分析

转座因子在生物体内广泛存在,它在研究基因的重组机理以及生物染色体的进化方面有着重要意义。IS10是细菌中的一种转座因子,它既能单独作为插入序列,也能作为Tn10的一部分进行转座。利用含sacB基因的质粒pXT3sacB,获得了由转座因子IS10插入而导致sacB基因失活的突变体。通过对插入突变体质粒DNA的序列测定（GenBank登记号为AY580883．1）,结果表明IS10两端分别包括22bp倒置重复区CTGAGAGATCCCCTCATAATTT和AAATCATTAGGGGATTCATCAG,这与前人的报道一致;而IS10两端的插入靶位点序列为TGCTTGGTT,该9bp靶位点序列与前人报道的序列NGCTNAGCN不同。根据文献资料,本研究中的靶位点序列是首次报道。此外,通过Southern blot杂交分析,插入sacB基因中的IS10来源于宿主大肠杆菌DH5α染色体DNA,并且IS10在DH5α染色体中为两个拷贝。此外,本研究利用sacB基因捕获到转座因子IS10,该方法为研究其他插入序列提供了一个有益的体系。     

核基质结合区提高稳定整合的CAT报告基因在NIH3T3细胞中的表达

通过PCR从人基因组扩增β珠蛋白核基质结合区(matrix attachment region,MAR)及β干扰素MAR,正向及反向克隆至pCAT3载体SV40启动子的上游,分别检测瞬时及稳定表达的情况下MAR在NIH3T3细胞内对CAT报告基因的影响情况。结果显示：瞬时表达情况下,反向及正向插入的MAR均不能提高CAT基因的表达;稳定整合的情况下,插入的β珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,β干扰素MAR提高3倍,反向及正向插入的MAR没有明显的差别。这表明MAR能在一定程度上提高外源基因的表达水平,并且不同的MAR对外源基因表达的影响存在差异,MAR的插入方向对外源基因的表达水平没有明显的作用。     

细菌插入序列的转座酶和转座机制

插入序列（insertion sequence, IS）是细菌中最简单的移动遗传因子,由两端的反向重复序列（inverted repeats, IR）和中间的转座酶 (transposase)编码序列组成。在细菌中,因为插入序列的转座酶催化活性中心氨基酸序列不同,所以将其转座酶分为DDE转座酶、DEDD转座酶、HUH转座酶和丝氨酸转座酶。在转座过程中,根据插入序列是否有复制,将插入序列的转座分为复制型转座（replicative -ansposition）和非复制型转座（non-replicative transposition）,而将形成夏皮罗中间体（Shapiro intermediate）的非复制型转座称为保守型转座（conservative transposition）。此外,插入序列通过不同的转座机制插入到基因编码区导致基因突变、缺失和倒置;或者插入到基因上游,通过自身启动子或与基因形成杂交启动子来影响插入序列下游基因的表达,从而帮助细菌抵抗复杂的环境变化。本文主要围绕细菌插入序列的特征、转座酶、转座机制和转座影响展开综述,以期为进一步研究插入序列的机制和插入序列在细菌中所起的作用提供参考。     

CMV与T7启动子对仙台病毒微小基因组拯救效率的比较

构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和T7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR T7/5细胞(稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与T7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或T7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pT7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR T7/5细胞,结果pT7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅T7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了T7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。     

杆状病毒介导对哺乳动物细胞的基因转移

将具有细胞毒效应的目的基因———Barnase基因置于CMV极早期启动子下游 ,利用Bac to Bac系统将上述表达盒插入AcNPV的ocu位相 ,构建重组病毒vAcCMVBar.感染HeLa等几种细胞后出现细胞毒性效应 ,其中一种人腹部肿瘤细胞的效应最为明显 ,剂量依赖分析是表达的Barnase所致 .因此认为 ,AcNPV是一种能感染具有一定的组织特异性的哺乳动物细胞的转基因载体 ,而Barnase基因表达产物造成细胞效应所需的量低于常规报告基因所需的评价水平     

人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)的上游调控区在大肠杆菌中也具有增强子样的效应

采用痘苗病毒7.5k、11k及N2启动子,以大肠杆菌β-半乳糖苷酶(β-lac)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)作为标记基因,构建了大肠杆菌增强子样序列的系列检测载体。采用上述检测载体发现人乳头瘤病毒6b(Human papillomavirus type 6b,HPV-6b)上游调控区(Upstream regulating region,URR)中540bp的Sau3A-Nar Ⅰ片段,在大肠杆菌中对痘苗病毒启动子控制的CAT基因的表达有明显的增强作用,可使基因表达提高4～5倍;对β-lac基因的表达可提高3～6倍。根据这一片段的插入方向增强基因表达水平有所不同。     

水稻重复序列RRD3在CHO和3T3细胞中的启动子活性

RRD3是通过变性 -复性动力学从水稻基因组中克隆到的一个中度重复序列 .将 RRD3作为启动子亚克隆到氯霉素乙酰基转移酶基因为报告基因的 p CAT载体上 ,转染 5种动物细胞 .结果表明在 CHO、3T3细胞中能够启动 CAT基因的表达 .利用核酸外切酶 和 PCR构建了 RRD3的系列缺失体 ,经转染后的 CAT活性分析表明 ,该序列中存在多个与哺乳动物细胞中启动基因表达有关的调控元件 .结合 RRD3在大肠杆菌和高等植物烟草中启动报告基因表达的活性 ,对重复序列与生物进化的关系进行了讨论 .     

链霉菌启动子的研究Ⅰ.灰色链霉菌启动子在大肠杆菌中的克隆和表达

灰色链霉菌(streptomyces griseus)No.45是链霉素产生菌,用于工业规模的链霉素生产,其启动子结构及基因表达的调控尚未揭示。本文报道了S.riseus启动子在大肠杆菌(Escherichia coil)中的克隆和表达,证实了S.griseus中也存在E.coli类型的启动子。我们已将S.griseus DNA的PstⅠ、BglⅡ酶切片段克隆到启动子探测质粒pGA46上,在大肠杆菌中表达四环素抗性基因启动子的功能。S.griseus DNA的Hin dⅢ酶切片段也已经克隆到另一个启动子探测质粒pPV33-H上,在E.coli中表达四环素抗性基因启动子的功能。为了进一步验证和分析,将重组质粒和载体以限制性内切酶酶切,从电泳图谱中可以重新找到共同的载体区带。以DNA分子杂交的方法进行DNA同源性分析,结果表明载体pGA46或pPV33-H和S.griseus DNA没有可察觉的杂交区带,而重组质粒和S.griseus DNA及载体均有明显的杂交区带。这说明重组质粒中的外源插入序列确是来自S.griseus,这些DNA片段携带了四环素抗性基因的启动子。为了进一步分析启动子功能区域的结构,已将重组质粒No.8中4.24kb的S.griseus插入序列缩短到1.89kb。插入序列的继续缩小正在进行中。     

受溶氧浓度调控的新型大肠杆菌表达系统

利用透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因在大肠杆菌中的转录过程受环境溶氧浓度调控,在贫氧条件下基因转录被激活的性质,构建了一个在贫氧条件下能高效表达外源基因的新型大肠杆菌表达系统。该表达系统包括一个古血红蛋白基因启动子元件控制T7RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒的宿主菌GJ100和另一个T7启动子控制外源基因表达的质粒载体。研究结果表明大肠杆菌本身的硫氧还蛋白,原核生物的金黄色葡萄球菌A蛋白IgG结合区(ZZ),真核生物的蛇神经毒素融合蛋白,鲑鱼降钙素六聚体,人白细胞介素Ⅱ和人尿激酶原等基因均能在该系统中获得高效表达。重组蛋白表达的水平可达细胞总蛋白的30％以上。     

基因组DNA甲基化及组蛋白甲基化

在真核生物中,DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传学标记,能影响染色质的结构和基因的表达。随着全基因组甲基化测序的发展,全基因组范围内的DNA甲基化水平得以了解。文章概述了基因组中启动子、基因本体、增强子、沉默子和转座子等不同元件的DNA甲基化的研究进展,以及DNA甲基化与基因表达调控间的关系。启动子的DNA甲基化对基因的表达有抑制作用,而基因本体的DNA甲基化与基因的表达关系因物种或细胞类型不同而异。增强子的DNA甲基化状态与基因活性呈反比关系,沉默子则相反呈正相关。转座子的DNA高度甲基化抑制其转座活性,从而维持基因组的稳定性。文章还探讨了DNA甲基化与组蛋白甲基化间的相互作用及其对基因表达、可变剪切、转录的调控作用,以及本领域的未来研究方向。     

插入序列IS2的研究：Ⅱ.突变体的极性效应和DNA序列分析

插入序列ＩＳ２插入某转录子后产生极性效应,研究Ⅰ发现左插和右插的极性效应不同。本研究（Ⅱ）表明,不同ＩＳ２左插后的极性效应也有很大差异。对ＩＳ２的ＤＮＡ序列分析表明,当ＩＳ２中ＯＲＦ的方向和被插入转录子的转录方向相同时为左插,极性效应较小,当ＩＳ２中ＯＲＦ的方向和被插入转录子的转录方向相反时为右插,极性效应较强。当ＩＳ２发生碱基突变出现终止密码子时,将增加左插的极性效应。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因启动子的分离和鉴定

用启动子探针型载体pFR109从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖苷酶基因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明:该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时,它仍能启动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去掉Y8片段5′端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。     

RNA干涉的最新研究进展

RNA干涉 (RNAi)是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程 .它是转录后基因沉默 (PTGS)的一种 .RNAi在生物界中广泛存在 .RNAi发生过程主要分为 3个阶段 :起始阶段 ,扩增阶段 ,效应阶段 .RNAi在维持基因组稳定、保护基因组免受外源核酸侵入、基因表达调控等方面发挥重要生物学作用 .RNAi作为基因沉默的一个工具 ,已被广泛用于基因功能研究、基因治疗和新药研究与开发等方面 .     

介绍一种PCR鉴定重组体DNA插入方向及转染的方法

介绍一种用ＰＣＲ方法鉴定重组体中插入片段的正、反连接方向及其是否导入细胞的方法．其原理是选择紧靠载体克隆位点上游的一段序列为上游引物,以扩增插入序列的上、下游引物分别作为下游引物进行ＰＣＲ．载体上游引物加插入序列的上游引物可扩出产物者为反向连接;加插入序列的下游引物可扩出产物者为正向连接．该法简单、快速,可广泛用于鉴定重组体中插入片段的正、反连接方向及基因转染时外源基因是否导入细胞内．     

pINC—lacZ逆转录病毒载体的构建及其在小鼠胚胎干细胞中的表达

小鼠胚胎干细胞系（ES）是从囊胚的内细胞团中建立起来的多潜能胚胎干细胞系。ES细胞系目前正广泛用于将基因打靶后后的突变和其它遗传变化导入小鼠的种系中。其中,嵌合鼠的获得是非常必要的一步。这就需要用一个可以广泛表达的基因对ES细胞进行标记。大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－gal）基因的表达在细胞水平就能很容易地观察到,而且对哺乳动物细胞没有任何毒害作用,因而是一个被广泛地用于各种细胞基因表达研究中的报导基因。猿类巨细胞病毒早期（SiCMVIE）启动子是一个广泛用于转基因小鼠研究中的强启动子。然而,该启动子在ES细胞方面的报道尚未见到。本研究用BamHI和HindIII双酶切,从psv-β-galactosidasec中得到3．7Kb的lacZ基因片断,将其插入妻pINC载体上（Fig.1) ,得到pINC－lacZ(Fig.2)。用NotI线性化pINC－lacZ后,电击导入MESPU－13细胞中。MESPU－13为本实验室从129／Tcr品系小鼠的囊胚中建立的一个ES细胞系。转化细胞在含有250μg/mlG418的培养基上培养两周,进行MESPU－13细胞稳定转化子的筛选。在一次转化实验中,佾1×10^7个转化的MESPU－13细胞中获得了4个G418抗性克隆。X－gal染色表明：其中3个克隆中有导入的基因表达。由于其中的一个细胞系MC15表现阳性染色（Fig.3)和很好的生长状态,对该系进行了进一步的研究。MC15细胞的二倍体核型正常率为72．4％。MESPU－13细胞不表现β－gal活性;另外,以lacZ基因为探针,对经过BamHI酶切过的MC15细胞基因组DNA进行的Southern分析显示：MC15细胞克隆中仅有一条要交带（Fig.4)。说明该细胞克隆中含有一个单考贝整合。在谱系分析中成功的细胞标记依赖于标记基因的稳定表达。许多强的启动子被用于基因表达的研究。例如鸡的β－肌动蛋白启动子。外源基因可以稳定地整合到未分化细胞的染色体上,然而它们的表达常常被抑制直到随后的分化过程中。本研究中我们首次用强的SiCMVIE启动子构建了pINC－lac载体,由SiCMVIE启动子引导转录的lacZ基因能够在ES细胞中表达。然而lacZ的表达仅存在于3个克隆中,另一个克隆并不表现β－gal活性。很可能在不同整合位为上基因的表达是不同的。     

与人PC-1同源的鼠PC-1基因的启动子的分子克隆和特性分析

为了鉴定鼠mPC-1基因表达的调控元件,克隆并分析了该基因的启动子.构建了一系列mPC-1基因启动子的截短序列.通过荧光素酶报道基因,分析了它们在前列腺癌细胞和其它细胞中的表达.结果表明,在AR阳性细胞系中,mPC-1基因启动子活性远远高于SV40和p61-PSA 启动子,mPC-1基因启动子 599 bp 至449bp 可能含有一个负调控元件; mPC-1 1.1 kb 启动子控制的表达主要在前列腺癌细胞系中; 雄激素可调控mPC-1 1.1kb 启动子表达.mPC-1 1.1kb 序列是一个有前列腺癌细胞特异性和较强的启动子,经过进一步的修饰有可能作为一种有用的前列腺癌基因治疗元件.     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae) 基因启动子的分离和鉴定

用启动子探针型载体pFR109从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae)总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖萤酶基因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明：该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时,它仍能启动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去掉Y8片段5’端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。     

人CD46启动子真核表达载体的构建

为了构建人CD46（hCD46）启动子指导目的基因表达的真核表达载体,提取HeLa细胞基因组DNA,用PCR扩增出hCD46基因的启动子区域,序列分析结果表明其与GenBank中hCD46基因5’端某片段的同源性为99.9％。用此启动子替换pcDNA3EGFP中的CMV启动子,并在hCD46启动子和EGFP基因之间插入兔β-球蛋白基因第二内含子（RGI）,得到的重组表达载体转染CHO和SP2/0两种鼠源细胞,流式细胞术检测表明CHO细胞EGFP的表达量高于SP2/0细胞,表达特性与人体CD46相似;RGI可以增强EGFP的表达量,但不改变其表达的组织特异性,提示克隆的hCD46启动子可以用于研制模拟人体CD46基因表达特性的转基因小鼠。     

两种被修饰鱼腥藻和大肠杆菌穿梭载体的分析

将穿梭载体pRLl和pRLlO经双亲接合从大肠杆菌转入鱼腥藻中后,发现两种被修饰的穿梭载体pRLlM和pRLlOM。经限制酶图谱和DNA序列分析表明,pRLlM和pRLlOM中分别含有插入序列因子IS2和lS10。DNA序列分析表明lS10为IS10-R和lS10-L的杂交体。由于插入序列因子．使宿主对氯霉索的抗性增加。Southern杂交表明在鱼腥藻的基因组DNA中不含IS10。