PICK1的结构与功能研究进展

PICK1蛋白是一个从线虫到人都高度保守膜周蛋白,在多种组织中表达,尤以脑和睾丸的表达最高.在细胞内,PICK1定位于核周区和诸如神经突触的特化细胞结构中.PICK1蛋白含一个PDZ结构域和一个BAR结构域,PDZ结构域能和许多膜蛋白结合.而BAR结构域能与脂质分子(主要为磷酸肌醇)相结合,通过这种机制PICK1可调节相关蛋白的亚细胞定位和膜表达.由于各蛋白与PICK1相互作用的PDZ结合基序不同,可利用与特定蛋白结合基序相同的PDZ结合多肤竞争性地结合PDZ结构域,特异性地阻断该蛋白的作用,从而特异性地增强或减弱PICK1在某组织中的作用,为PICK1的临床应用提供了药理基础.     

蛋白激酶Ca相互作用蛋白的结构与功能

蛋白激酶Cα相互作用蛋白(proteininteractingwithCαkinase,PICK1)是蛋白激酶Cα(proteinkinaseCα,PKCα)的靶蛋白之一,也是在PKCα和突触后膜受体蛋白间起重要作用的衔接蛋白。PICK1分别由PDZ结构域、BAR结构域以及卷曲螺旋区和酸性氨基酸区组成。PICK1中的PDZ结构域和受体蛋白、转运蛋白、衔接蛋白的相互作用报道较多,BAR结构域则与支架蛋白、质膜等相互作用。PICK1在突触可塑性、神经递质传递、外周神经感觉、细胞生长和黏连等方面发挥重要作用。本文对PICK1的结构和功能进行综述。     

蛋白激酶Cα相互作用蛋白的结构与功能

蛋白激酶Cα相互作用蛋白（protein interacting with Cα kinase,PICK1）是蛋白激酶Cox（protein kinase Cα,PKCα）的靶蛋白之一,也是在PKCα和突触后膜受体蛋白间起重要作用的衔接蛋白。PICK1分别由PDZ结构域、BAR结构域以及卷曲螺旋区和酸性氨基酸区组成。PICK1中的PDZ结构域和受体蛋白、转运蛋白、衔接蛋白的相互作用报道较多,BAR结构域则与支架蛋白、质膜等相互作用。PICK1在突触可塑性、神经递质传递、外周神经感觉、细胞生长和黏连等方面发挥重要作用。本文对PICK1的结构和功能进行综述。     

PICK1蛋白C端酸性区域对其功能的调节

蛋白激酶C相互作用蛋白1(protein interacting with Ckinase1,PICK1)是调节AMPA(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受体在细胞膜上的数量与分布,引起LTP与LTD现象的重要蛋白.本文利用基因克隆、荧光光谱以及免疫分析等方法,分析了PICK1蛋白C末端酸性区对BAR结构域与膜脂结合能力以及PICK1分子内BAR(Bin/amphiphysin/RVS)结构域与PDZ结构域相互作用的影响,研究了钙离子结合C末端酸性区后对上述相互作用的调节.结果显示,C末端酸性区的存在使BAR结构域与膜脂的结合能力减弱大约10倍,但PICK1分子内的BAR与PDZ结构域的相互作用与不含C末端的酸性区相比增强了大约4倍.另一方面,C末端酸性区的存在,伴随钙离子浓度的提高,有助于增强BAR与膜脂的结合,却削弱了PDZ和BAR结构域的作用.当钙离子浓度增加到500μmol/L时,BARC的脂质结合能力以及和PDZ的亲和力与不含酸性区相当.     

Erbin:LAP家族的新成员

Erbin(ErbB2结构蛋白）是LAP家族新成员,它的N末端有16个富含亮氨酸的重复序列（LRR）,在LRR后有一个LRR样的结构域,C末端含有PDZ结构域,实验证明Erbin通过其PDZ结构域与ErbB2结合。在上皮和神经元等级性细胞中,Erbin对ErbB2的定位或定向转移具有重要作用,并可增加ErbB2在细胞表面的表达量。Erbin作为支架蛋白还参与了细胞骨架的形成。     

多功能的胞内衔接蛋白syntenin

Syntenin蛋白是在原核生物及真核生物中广泛存在的一类胞内衔接蛋白（adaptor proteins）. Syntenin由N端结构域（N-terminal domain,NTD）、两个串联的PDZ结构域(postsynaptic density protein, disc large and zonula occludens, PDZ)和C端结构域（C-terminal domain,CTD）组成,在生物进化过程中相对保守. Syntenin蛋白的PDZ结构域可与不同膜受体C端的PDZ结合基序（PDZ-binding motif,PBM）特异性结合, PDZ结构域结合受体的多样性导致了syntenin功能的多样性. 本文综述了syntenin蛋白的发现与分布及其结构特征,对syntenin在肿瘤转移、细胞质膜蛋白组装、参与动物免疫等领域的研究成果进行了较为详细的综述,同时介绍了syntenin在参与动物胚胎发育调控、血管生成和轴突生长等方面的研究进展.     

PDZ结构域的结构特点及其识别特异性配体的机制

PDZ结构域作为介导蛋白质之间相互作用的重要结构域之一,参与到细胞内运输、离子通道、以及各种信号传导通路等多种生物学过程.PDZ结构域是由80~100个氨基酸组成的小的球状结构域,对某些多PDZ结构域蛋白来说,需要一前一后形成串联体才能正确折叠.另外,PDZ结构域相互之间也可以形成同源或异源二聚体.这些PDZ结构域的突出特点是能特异性地识别配体靶蛋白C末端短的氨基酸序列,但有些也能识别靶蛋白的内部β发夹结构.而一些支架蛋白的PDZ结构域与细胞膜上脂类的相互作用则增加了其与膜的亲和性.本文简要概括了PDZ结构域的结构特点及其对配体的各种特异性识别的机制,从而为研究各种PDZ蛋白的功能提供了结构基础.     

BAR结构域蛋白质的功能

近期对果蝇双载蛋白(amphiphysin)BAR结构域晶体结构的报道,使得BAR结构域研究成为热点。虽然在序列水平上保守性较低,但双载蛋白的BAR结构域与Arfaptin 2的GTP酶结合结构域在结构上极为相似。通过对两种蛋白质的BAR结构域同源序列进行检索分析,发现了大量含BAR结构域相关蛋白质。研究发现,BAR结构域蛋白质多数都参与细胞内物质转运及胞吞作用;BAR结构域不仅可以通过其二聚化基元感知和诱导膜的弯曲,而且某些蛋白质的BAR结构域还具有与小GTP酶结合的功能。     

大鼠MUPP1蛋白PDZ8结构域的生化及晶体结构特性

多重PDZ结构域蛋白1型（MUPP1）是一种存在于上皮细胞和神经细胞内含有13个PDZ结构域的重要支架蛋白.在上皮细胞中,MUPP1蛋白在紧密连接结构的形成和上皮细胞的极化过程中发挥重要作用.而在中枢神经系统中,MUPP1基因的1个提前终止突变导致了其最后12个PDZ结构域的缺失,以及严重的先天性脑积水.此外,MUPP1蛋白的表达水平与酒精依赖性和药物戒断的严重性也具有显著的相关性.因此,对MUPP1蛋白所含的PDZ结构域进行纯化和性质鉴定,将有助于深入研究MUPP1蛋白的功能和分子机制.在本文研究中,利用亲和纯化和分子筛技术,对大鼠来源的MUPP1蛋白的第8个PDZ结构域进行了表达和纯化.多角度激光光散射的数据表明: MUPP1-PDZ8结构域在溶液中为单体,分子量为16.4 kD.圆二色谱结果表明,MUPP1-PDZ8结构域具有较好的二级结构折叠,测得其熔解温度为71.6摄氏度,暗示该PDZ结构域在溶液中非常稳定.最后,MUPP1-PDZ8结构域的晶体结构显示,该结构域属于I 型PDZ 结构域,包含3个α螺旋和6个β折叠.其中GLGL模块、β折叠B上的1 351位亮氨酸,以及α螺旋B上的1 405位异亮氨酸/1 398位组氨酸形成的PDZ结合口袋,可以特异性地与其目标蛋白质的羧基末端相结合.综上所述,本文的研究提供了MUPP1-PDZ8结构域的生化特性,以及该结构域与其目标蛋白质相互作用的分子机制,这将为MUPP1蛋白的功能研究提供生物化学与结构生物学的理论基础.     

验证性筛选PDZ结构域结合配体文库快速研究HtrA2/Omi PDZ结构域的结合特性

HtrA2/Omi是一种线粒体丝氨酸蛋白酶, 在哺乳动物细胞中具有双重功能, 即诱导细胞凋亡和参与维持线粒体活性的动态平衡. PDZ结构域是最重要的蛋白质相互作用结构域之一, 参与多种生物学过程, 如细胞信号转导、蛋白质降解、细胞骨架组织等. 最近研究发现, HtrA2/Omi蛋白的PDZ结构域与配体的相互作用, 可以调节HtrA2/Omi蛋白自身的水解酶活性.以HtrA2/Omi PDZ结构域为研究对象, 用酵母双杂交系统验证性筛选PDZ结构域结合配体文库, 快速研究该结构域的结合特性, 并在人类全蛋白质组范围内预测并发现该结构域新的相互作用蛋白, 最后分析这些新的相互作用所能够形成的最小相互作用网络来评估其可信度. 研究结果揭示了HtrA2/Omi PDZ结构域新的结合特性, 即: 不仅能够结合已报道的II类PDZ配体而且还可以结合I类和III类PDZ配体, 并且配体-3位氨基酸具有一定范围内的可变性. 而且, 发现了7个新的HtrA2/Omi PDZ结构域相互作用蛋白, 为进一步阐明HtrA2/Omi蛋白的生物学功能提供了重要线索. 同时证明了验证性筛选目的结构域结合配体文库, 这一结构域结合特性研究新策略的实用性和高效性.     

PDZ结构域介导的PIP脂质信号转导

PDZ结构域是调控蛋白质/蛋白质相互作用的一类重要结构域,能特异结合蛋白质C末端一段有规律的氨基酸序列。含有PDZ结构域的支架蛋白能够组装成超大的蛋白质复合体来调控细胞内的信号转导通路。最新研究表明,PDZ结构域还能与PIP脂质直接相互作用,从而参与调控PIP脂质信号通路。将综合最新研究进展,阐明PDZ结构域与PIP脂质的作用方式,以及对相关PIP脂质信号转导的调控过程。     

PICK1：一个功能多样的药靶蛋白

蛋白质是生命功能的执行者.生命体中某些关键蛋白的功能异常往往是导致疾病发生的根本原因.这些疾病相关蛋白极有可能成为药物靶点,为新药研发和疾病治疗提供重要线索. PICK1蛋白（protein interacting with Cα kinase 1）结合能力广泛、功能多样以及在多种重要疾病（如：癌症、精神分裂症、疼痛、帕金森综合症等）的发生发展过程中发挥潜在的作用,使其成为一个可能的药靶蛋白. PICK1与绝大多数配体蛋白的相互作用是通过其PDZ结构域与配体C末端区域的结合介导的,使PICK1的PDZ结构域成为一个潜在的药物靶点.因此,可以利用生物小分子物质特异性地结合PICK1的PDZ结构域,干扰或阻断PICK1与配体蛋白的天然相互作用,最终达到治疗相关疾病的目的.     

A型流感病毒NS1蛋白羧基端PL结构域影响NS1在细胞核内的定位

A型流感病毒NS1蛋白羧基端4个氨基酸可以与PDZ结构域(the domain of PSD95,Dig and ZO-1)相结合,称为PL结构域(PDZ ligand domain)．对不同亚型或毒株的流感病毒而言,其NS1蛋白PL结构域的组成存在比较大的差异．有研究发现这种差异能够影响NS1与宿主细胞蛋白的相互作用进而影响病毒的致病力．为进一步探讨PL结构域对NS1蛋白生物学特性的影响,首先构建出4种不同亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H9N2)来源的NS1绿色荧光蛋白表达质粒．在此基础上,对野生型H3N2病毒NS1表达质粒进行人工改造,将其PL结构域缺失或者替换为其他亚型流感病毒的PL结构域,制备出4种重组NS1蛋白表达质粒．通过比较上述不同NS1蛋白在HeLa细胞中的定位情况发现,只有野生型H3N2病毒的NS1蛋白可以定位于核仁当中,而野生型H1N1、H5N1、H9N2病毒的NS1蛋白以及PL结构域缺失或替代的H3N2病毒NS1蛋白都不能定位于核仁．而通过比较上述NS1蛋白在流感病毒易感的MDCK细胞中的定位,进一步发现所有这些蛋白均不定位于核仁．上述结果表明：PL结构域的不同可以明显影响NS1蛋白在HeLa细胞核内的定位和分布,这有可能造成其生物学功能的差异．同时,NS1蛋白在细胞核内的定位还与宿主细胞的来源有着密切关系．     

通过筛选随机多肽文库研究ZO-1中PDZ1结构域的配体结合特点

选择ZO-1的PDZ1结构域作为研究对象,以酵母双杂交为筛选系统,筛选随机多肽文库和与其它PDZ结构域的配体进行相互作用,阐明ZO-1 PDZ1的配体结合特性.ZO-1 PDZ1识别配体C末端保守的氨基酸序列通式可以表示为：［S/T］［F/Y/W］［V/I/L/C］-COOH、［S/T］［K/R］V-COOH、V［F/Y/W］［L/C］-COOH、EYV-COOH.研究发现ZO-1 PDZ1的配体同时具有3种传统PDZ结构域配体的特点,不同的是其结合配体-1位对芳香族氨基酸具有强烈的偏好性.并且某些PDZ结构域配体的-1位和-3位对结构域与配体相互作用的特异性和亲和力有重要的作用.随后通过生物信息学的方法在Swiss-Prot数据库找到与此识别规律相符合的天然人类蛋白质.根据蛋白质的功能和细胞定位等性质选择10个配体用酵母双杂交验证相互作用.证实的相互作用配体有4个.本研究希望用这样的研究策略建立一种有效的研究蛋白质相互作用的方法,通过在全蛋白质组规模上对含有结合配体保守氨基酸序列的蛋白质的查询,理论上可以找到现有数据库中所有可能与目的结构域结合的潜在配体蛋白,特别是那些筛选cDNA文库不容易获得的低丰度配体.     

结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的亚细胞定位

【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和EGFP序列,一并插入真核表达载体构建出pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP。将构建好的质粒瞬时转染L929细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光、流式细胞分选以及Western blotting检测融合蛋白的表达以及亚细胞定位。【结果】成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP,瞬时转染L929细胞后融合蛋白tRv3194c定位于线粒体膜上,且重组痘苗病毒vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。【结论】Rv3194蛋白的PDZ结构域与线粒体外膜相关蛋白结合,为了解该蛋白在细胞内的致病机制提供重要线索。     

结构域B在鼠冠状病毒S蛋白的抗原性及膜融合中的作用

棘突(spike, S)蛋白是冠状病毒表面必不可少的跨膜糖蛋白,在病毒进入宿主细胞时具有结合受体和诱导膜融合的双重作用。大部分冠状病毒S蛋白的受体结合域位于S1-CTD(即相对应的结构域B),而经典的乙型冠状病毒模型鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)的受体mCEACAM1a与S1-NTD(即相对应的结构域A)结合,其结构域B的作用仍未完全清楚。本研究通过构建结构域B和S2膜融合元件的缺失突变体,并使其在鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a内成功表达,证实了结构域B对病毒S蛋白导致的细胞-细胞间膜融合是必需的。用不同方法处理的病毒颗粒作为抗原免疫小鼠,所获得的多克隆抗体进一步显示,结构域B不但是S蛋白的主要抗原决定簇,而且能诱导中和抗体明显抑制病毒感染和S蛋白介导的膜融合作用。此结果为阐述不同冠状病毒的致病性与感染性差异提供了新思路。     

PICK1中N端酸性区域对其PDZ结构域脂质结合能力的调节

蛋白激酶Cα相互作用蛋白1(protein interacting with Cα kinase 1, PICK1)是衔接膜上受体和蛋白激酶Cα的重要蛋白.利用荧光光谱结合定点突变技术 、蛋白与脂质覆盖法等方法,分析了PICK1蛋白N末端区域几个酸性氨基酸残基对PDZ 结构域与膜脂结合的影响,以及钙离子结合N末端酸性区域对PDZ脂结合能力的调节. 结果显示, 带有上游酸性区域的PDZ结构域（NPDZ）的脂质结合能力仅相当PDZ结构 域的15%,相比单独的PDZ结构域与脂质的解离常数Kd(PDZ)为1.58×103 μg·L-1, NPDZ与脂质解离常数Kd(NPDZ)为3.3×104μg·L-1,其中在N末端酸性残基中D8与 D12两个天冬氨酸是影响脂质结合能力减弱的关键残基,若将二者分别突变为丙氨酸 后,NPDZ与脂质的解离常数分别为：Kd (D8/A)=4.42×103μg·L-1;Kd (D12/A) =1.73×103μg·L-1接近于PDZ结构域与脂质结合能力;钙离子会增强NPDZ脂结合能力,当钙离子浓度达到30 μmol/L时,NPDZ的脂结合能力提高2.3倍,但只相当于PDZ的50% 的结合能力.     

肿瘤转移相关基因syntenin的融合表达及纯化

肿瘤相关基因syntenin在乳腺癌的转移和浸润过程中发挥重要作用。syntenin基因编码蛋白的C端有2个串联的PDZ(PDZ1和PDZ2)结构域,它们与该蛋白的功能密切相关。PDZ结构域存在于多种蛋白质中。用PCR方法扩增了syntenin全长、N端（ΔPDZ)、串联重复的PDZ(2PDZ)、PDZ1和PDZ2结构域编码序列,并将其以正确相位与pGEX-2T载体中的GST序列编码融合,构建成重组质粒pGST-syntenin、pGST-ΔPDZ、pGST-2PDZ、pGST-PDZ1和pGST-PDZ2。将这些重组质粒分别转化E．coli DH50α后,分别表达了相应的GST融合蛋白。Westem blot检测结果表明,2种融合蛋白均能与GST抗体反应。表达的GST融合蛋白经谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析获得了纯化的融合蛋白,为PDZ结构域及其相关蛋白功能研究提供了有用的材料。     

新基因人MOB cDNA的克隆与功能分析

人MOB基因被认为是在脑组织中高表达的5次跨膜而功能未知的膜蛋白.从胎儿和成人肾脏消减杂交cDNA文库中获得了一条新的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）序列,该序列对应于功能未知的MOB基因.利用生物信息学分析工具和分子生物学技术,从胎儿肝脏中成功地克隆了人MOB基因cDNA序列,同时也获得了含有完整开放读码框的大鼠和鸡MOB的电子全长序列.人MOB基因定位于10q11.1～11.2之间,含有一个1 242 bp的开放阅读框,第415位开始的ATG可能是翻译起始位点.核酸序列相似性搜索发现,其他种属中存在与之高度相似的EST序列,如爪蟾（79%）、羊（87%）、猪（94%）、牛（93%）.蛋白质序列相似性搜索发现,人MOB与大鼠、小鼠和鸡MOB有97%、97%、91％的相似性,与其他一些不同种属来源的假想蛋白有45%～73%的相似性.不同物种之间MOB基因核酸和蛋白质序列的高度相似说明,MOB是进化上高度保守的蛋白质.保守结构域分析发现,人、小鼠、大鼠和鸡MOB结构域组成完全一致,N端均与不育α基序（sterile alpha motif,SAM）结构域显著匹配,随后出现匹配显著性稍差的几个结构域.核酸和蛋白质序列的保守性提示,除N端约70个氨基酸组成SAM结构域外,其余的保守氨基酸可能形成一个新的保守的MOB结构域.表达谱分析表明,人MOB基因在所有被检组织和细胞中都表达.亚细胞定位研究显示,人MOB广泛表达于细胞内,主要在细胞核.DNA含量测定结果表明,人MOB基因过表达并不影响HeLa细胞的细胞周期和凋亡.总之,人MOB蛋白是一个在多种组织和细胞中广泛表达、细胞内广泛分布、进化上十分保守的蛋白质,可能通过特定蛋白质之间的相互作用,参与多种发育过程的调节.其过表达不影响HeLa细胞的周期和凋亡.