视黄醇结合蛋白4在病理妊娠中的研究进展

视黄醇结合蛋白4(Retinol binding protein 4,RBP4)是近年来新发现的一种脂肪细胞因子,在动物与人类的研究中均发现其与胰岛素抵抗的发生及糖、脂代谢的调节密切相关,随着机体胰岛素抵抗及糖脂代谢异常程度的增加,RBP4水平上升。在妊娠期,母体脂肪量增加并伴有不同程度的胰岛素抵抗。在正常妊娠时,RBP4随着妊娠的进展而升高,且与胰岛素抵抗程度增加相一致。与正常妊娠相比,妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)患者的RBP4升高更明显,且RBP4的升高水平与GDM预后相关。研究发现早期RBP4的升高可以预测GDM的发生,此外控制RBP4水平可能干预GDM发展。RBP4在妊娠期高血压疾病中升高;RBP4在脐血中的水平与胎儿生长密切相关,在小于胎龄儿中水平下降,在大于胎龄儿中升高;RBP4与早产的关系并不明确。进一步研究RBP4在病理妊娠的作用机制,可为病理妊娠的发生发展和防治提供新方向。     

脑卒中后抑郁患者视黄醇结合蛋白4和结合珠蛋白的研究

目的:通过观察脑卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)患者血清结合珠蛋白(Hp)和视黄醇结合蛋白4(RBP4)的水平变化,进一步明确PSD可能的作用机理。方法:以缺血性脑卒中患者为研究对象,采用汉密尔顿抑郁量表(HAMD)筛选符合条件的卒中后抑郁患者35例,选择不伴抑郁的卒中病人35例为对照组。于住院第3周,应用酶联免疫吸附法检测病人血清Hp和RBP4的水平。结果:卒中后抑郁组血清Hp和RBP4浓度[分别为(130.89±15.86)mg/L、(36.45±5.02)mg/L]较对照组[分别为(92.42±15.74)mg/L、(28.57±5.08)mg/L]明显增高,差异有显著性意义(P0.05)。脑卒中后重度抑郁组血清Hp和RBP4的水平[分别为(146.83±10.08)mg/L、(40.83±4.28)mg/L]显著高于轻度抑郁组[分别为(113.67±9.18)mg/L、(31.76±4.11)mg/L]及中度抑郁组[分别为(130.73±5.11)mg/L、(36.37±1.17)mg/L],中度抑郁组亦高于轻度抑郁组(P0.05)。血清Hp和RBP4水平与HAMD评分的Pearson相关分析表明两者显著相关(相关系数分别为:r=0.913、P0.01;r=0.800、P0.01)。结论:PSD组中血清Hp和RBP4水平相对于对照组有明显增高,并且该组中Hp和RBP4的水平变化与抑郁程度显著正相关,提示血清Hp和RBP4可能在脑卒中后抑郁的发病机理中起着重要作用,并在一定程度上可反映脑卒中后抑郁的严重程度,并指导临床诊疗。     

视黄醇结合蛋白的分离纯化及其抗血清的制备

建立了经硫酸铵分级、DEAE-Sephadex A25柱、Sephadex G200柱、Ultrogel ACA44柱和 Sephadex G100柱层析分离纯化人血浆视黄醇结合蛋白的方法.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,其纯度达到电泳纯.以此电泳纯的视黄醇结合蛋白免疫家兔得到了高效价的抗血清.     

视黄醇结合蛋白4在非酒精性脂肪肝病大鼠组织中的表达

目的：视黄醇结合蛋白4（RBP4）在非酒精性肝脂肪变模型大鼠中的表达情况,以探求其在疾病发生、发展中的意义。方法：40只wistar大鼠随机分为对照组和造模组,分析各组在2、4、6、8周4个时间点血清ALT、AST、TG、TC的变化及肝组织RBP4的表达情况。结果：随着造模时间延长,造模组大鼠肝脏脂肪变越来越明显,血清ALT、AST、TG、TC逐渐升高（p〈0.05）。造模组肝组织RBP4的mRNA的表达随造模时间逐渐增强;造模组免疫组化结果发现,RBP4的表达随造模时间逐渐增强（p〈0.05）。结论：在大鼠非酒精性脂肪肝模型中,RBP4的表达随造模时间延长而增加,与同期对照组相比有统计学差异,因此RBP4可能作为一个敏感的指标反映非酒精性脂肪肝的发生及发展情况。     

狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备

为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac E.coli感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M。用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M。用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价。结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力。本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础。     

视黄醇结合蛋白4在非酒精性脂肪肝病大鼠组织中的表达

目的:视黄醇结合蛋白4(RBP4)在非酒精性肝脂肪变模型大鼠中的表达情况,以探求其在疾病发生、发展中的意义。方法:40只wistar大鼠随机分为对照组和造模组,分析各组在2、4、6、8周4个时间点血清ALT、AST、TG、TC的变化及肝组织RBP4的表达情况。结果:随着造模时间延长,造模组大鼠肝脏脂肪变越来越明显,血清ALT、AST、TG、TC逐渐升高(p<0.05)。造模组肝组织RBP4的mRNA的表达随造模时间逐渐增强;造模组免疫组化结果发现,RBP4的表达随造模时间逐渐增强(p<0.05)。结论:在大鼠非酒精性脂肪肝模型中,RBP4的表达随造模时间延长而增加,与同期对照组相比有统计学差异,因此RBP4可能作为一个敏感的指标反映非酒精性脂肪肝的发生及发展情况。     

人端粒结合蛋白TRF1的克隆、表达和抗体制备

利用RT-PCR技术,从HeLa细胞的cDNA文库中扩增到人端粒结合蛋白1(hTRF1)基因编码区序列,克隆至pUCm-T载体,测序正确后,构建带His₆-tag原核表达载体pET-28c-TRF1,经IPTG诱导表达的His₆-TRF1融合蛋白分子量约为65kD,Western-blot证实表达产物可特异地与TRF1抗体sc-6165结合。用Ni^2＋NTA胶亲和层析纯化可得到电泳均一的融合蛋白,免疫新西兰纯种大白兔,获得特异性好的多克隆抗体,该抗体可用于免疫荧光染色和Western-blot方法检测哺乳动物细胞内源性的TRF1分子。     

纤维连接蛋白细胞结合区功能多肽在杆状病毒表达系统中的表达与纯化

目的：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纤维连接蛋白（FN）细胞结合区功能多肽（CBD）,并对其进行纯化和鉴定。方法：经PCR获得人血浆FN-CBD基因,酶切后定向克隆到T载体上,经测序正确后插入pFastBacHTB载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞;用抗生素平板筛选重组杆粒,脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞并进行蛋白表达;经Ni-NTA层析柱对重组多肽进行纯化,对纯化的多肽行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果：得到融合6个组氨酸残基的FN-CBD,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为36000,Western-blot表明该多肽能与FN的多克隆抗体结合。结论：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能成功表达出人血浆FN-CBD,且表达产物具有良好的免疫原性,为后续结构、功能研究奠定了基础。     

采用杆状病毒/昆虫表达系统纯化蛋白制备抗hUTP14a多克隆抗体

为制备兔抗人hUTP14a多克隆抗体并鉴定其抗体的特异性,本研究通过杆状病毒/昆虫表达系统制备并纯化Flag-hUTP14a-his蛋白,免疫新西兰家兔。ELISA方法检测免疫兔的抗血清滴度达到1∶10~5(体积比)时取血清,并通过Protein A免疫亲和层析柱纯化抗体。在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中过表达Flag-hUTP14a,或用小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)沉默内源的hUTP14a蛋白表达后,提取细胞总蛋白质。经Western印迹分析制备的多克隆抗体的特异性;通过细胞免疫化学染色、细胞免疫荧光、免疫组织化学染色和免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)实验对hUTP14a抗体的特异性进行鉴定。研究证实,制备的抗hUTP14a多克隆抗体能够特异性识别内源及外源表达的hUTP14a蛋白。该抗体可以用于细胞免疫荧光、细胞免疫化学染色、免疫组织化学染色、Western印迹及免疫沉淀等技术,为进一步研究hUTP14a的生物学功能提供了特异性抗体。     

人骨形成蛋白3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化及其诱骨活性检测

为了在昆虫杆状病毒系统中表达人骨形成蛋白 3(humanbonemorphogeneticproteoin3,hBMP3) ,检测表达产物的诱骨活性 .将hBMP3全长cDNA 1416bp克隆入转移载体K8中 ,再与病毒DNA经脂质体包裹后转染昆虫细胞Sf9.重组病毒经蓝白筛选后 ,用PCR方法扩增目的基因片段进行初步鉴定 .收集重组病毒的转染上清 ,肝素亲和层析纯化目的蛋白 .SDS PAGE和Western印迹进一步鉴定此蛋白 .体外培养MC3T3 E1细胞 ,经目的蛋白刺激后 ,检测细胞内碱性磷酸酶 (ALP)活性 .并将目的蛋白进行小鼠体内肌肉包埋实验 ,检测其异位诱骨活性 .结果显示 ,肝素亲和层析可以收集 1个高的洗脱峰 .SDS PAGE显示 ,非还原型样本为 32kD的二聚体蛋白带和少量 16kD单体蛋白带 ;还原型样本仅有相应大小的单体蛋白带 ,纯度达 80 % .Western印迹在相应位置呈阳性染色 .此蛋白刺激小鼠成纤维细胞 4 8h后 ,胞内ALP的活性增高 ,经rhBMP3作用后的细胞MTT染色减弱 .在小鼠股部肌肉内包埋蛋白样品 2～ 3周 ,组织学检测有成骨组织生成 .说明hBMP3在此套系统中获得了表达 .表达产物在体外可以刺激成骨细胞的分化 ,却抑制细胞的增殖 .小鼠体内异位诱骨实验进一步证实表达产物具有成骨活性     

Expression and purification of the matrix protein of Nipah virus in baculovirus insect cell system

Nipah virus (NiV) causes fatal respiratory illness and encephalitis in humans and animals. The matrix (M) protein of NiV plays an important role in the viral assembly and budding process. Thus, an access to the NiV M protein is vital to the design of viral antigens as diagnostic reagents. In this study, recombinant DNA technology was successfully adopted in the cloning and expression of NiV M protein. A recombinant expression cassette (baculovirus expression vector) was used to encode an N‐terminally His‐tagged NiV M protein in insect cells. A time‐course study demonstrated that the highest yield of recombinant M protein (400–500 μg) was expressed from infected cells 3 days after infection. A single‐step purification method based on metal ion affinity chromatography was established to purify the NiV M protein, which successfully yielded a purity level of 95.67% and a purification factor of 3.39. The Western blotting and enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) showed that the purified recombinant M protein (48 kDa) was antigenic and reacted strongly with the serum of a NiV infected pig. © 2015 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 32:171–177, 2016     

GST-Ccd1融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：利用大肠杆菌DH5α表达GST—Ccd1融合蛋白,并用亲和层析分离纯化,进行动物免疫制备多克隆抗体。方法：利用本室构建好的pGEX-5X-1-Ccd1-N原核表达重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得可溶性表达。经谷胱甘肽Sepharose 4B介质填充的层析柱分离纯化蛋白,制备抗原免疫动物,得到Ccd1的兔源多克隆抗体。结果：ELISA结果显示血清抗体效价可以达到1∶40 000。免疫组化分析表明自制的抗体能特异性与Ccd1蛋白相互作用,可以用于实验分析。结论：制备了效价高特异性良好的抗Ccd1多克隆抗体,经实验验证获得的抗体能够满足针对Ccd1的免疫印迹和免疫组化检测的实验要求,为今后深入研究Ccd1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有用的实验工具。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

hPARP1酶在杆状病毒/昆虫细胞中的高表达及快速纯化

PARP1是动物细胞内的一种重要的DNA修复酶。近几年PARP1作为新型的抗癌靶点,受到广泛的关注。为了获得高活性的PARP1,首先将hPARP1基因克隆到载体pFastBacTM1中,构建转移载体pFast-hPARP1;然后转化大肠杆菌Escherichia coli DH10Bac感受态细胞中。其次,通过位点特异性转座,将hPARP1基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid-hPARP1。最后,通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞。Western blotting和酶活测定法对hPARP1的表达和活性进行分析。采用3-氨基苯甲酰胺亲和层析柱对收获的昆虫细胞中表达的hPARP1酶进行纯化。Western blotting结果表明在昆虫细胞中hPARP1酶表达成功。经3-氨基苯甲酰胺亲和层析柱纯化后,Sf9昆虫细胞表达出的hPARP1酶的比活由0.051 nmol/(minμg)提高到了1.988 nmol/(min.μg),而且每100 mL的细胞中能够收获约3.2 mg酶。实验结果为PARP1大规模生产和应用提供了可参考利用的技术。     

Expression of human immunodeficiency virus genes using baculovirus expression system

The structural protein genes of HIV-1 and HIV-2 have been expressed inSpodoptera frugiperda (SF) cells using baculovirus expression system. The noncoding flanking sequences of HIV structural genes were removed and a putative ribosome binding site was placed in front of the open reading frame of each gene by using crossover linker mutagenesis. The coding sequences of thegag, pol, env, andvif proteins were inserted intoAutographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) so that HIV genes were under the control of the AcNPV polyhedrin promoter. All recombinant AcNPV-infected SF cells express high levels of HIV structural proteins. Detailed strategies of recombinant AcNPV construction for high level protein expression are presented.     

Expression of the fusion protein recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor and leukemia inhibitory factor in a baculovirus vector system

A fusion gene coding human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and leukemia inhibitory factor (LIF) cDNAs was inserted into the transfer vector pSXIVVI⁺ X3 with the control of Syn and XIV promoters. The Sf9 cells (Spodoptera frugiperda) were co-transfected with the recombinant plasmid and TnNPV DNA (Trichoplusia ni nuclear polyhedrosis virus DNA). The fusion protein recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and leukemia inhibitory factor (LIF) could be synthesized in cells infected with recombinant virus at a level of about 23% of their total cellular protein. Activity analysis of the fusion protein in infected cells revealed that it exhibited the dual activities of GM-CSF and LIF. Western blot analysis of the expressed fusion protein in infected larvae showed that the virus-mediated fusion protein, with a molecular weight of ∼35 kDa, is confirmed with immunoreactivity. Received 02 December 1998/ Accepted in revised form 07 May 1999     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备

丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员.本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyx mori serpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础.首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经...     

The antibody preparation and expression of human Pescadillo

To explore the biological roles of human Pescadillo and investigate its potential effect on tumorigene sis, the eDNA of Pescadillo was fused with that of GST. After purification and elution, the purified GST-Pescadillo fusion protein was obtained, and the antibody against the fusion protein was generated.Endogenous Pescadillo protein was observed to be remarkably induced by estrogen. It was mainly distributed in the tissues such as breast, ovary and intestine, all of which contain proliferating cells,and was also detected in many cell lines of human cancer: renal carcinoma, hepatoma, ovarian cancer,colon carcinoma, and breast cancer. The expression level of Pescadillo was increased significantly in breast cancer tissues compared with their paired margin tissues. Taken together, these data suggest that Pescadillo may play important roles in the initiation and development of cancer and may be a potential target in cancer diagnosis and therapy.     

The antibody preparation and expression of human Pescadillo

To explore the biological roles of human Pescadillo and investigate its potential effect on tumorigenesis, the cDNA of Pescadillo was fused with that of GST. After purification and elution, the purified GST-Pescadillo fusion protein was obtained, and the antibody against the fusion protein was generated. Endogenous Pescadillo protein was observed to be remarkably induced by estrogen. It was mainly distributed in the tissues such as breast, ovary and intestine, all of which contain proliferating cells, and was also detected in many cell lines of human cancer: renal carcinoma, hepatoma, ovarian cancer, colon carcinoma, and breast cancer. The expression level of Pescadillo was increased significantly in breast cancer tissues compared with their paired margin tissues. Taken together, these data suggest that Pescadillo may play important roles in the initiation and development of cancer and may be a potential target in cancer diagnosis and therapy. Supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 30500191, 30530320, 30470378, and 30625035)     

D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及多克隆抗体的制备

为了开发以D1蛋白酶作为靶标的新型除草剂,需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。从菠菜中提取总RNA,逆转录合成cDNA,采用PCR扩增了CtpA的基因,连接至表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达,通过降低IPTG和诱导温度获得了可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE和Western blotting结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物,采用高效液相色谱法测定了其水解活性,结果表明活性可达1.10nmol/(mg·min),为文献报道数据的15倍。纯化后的CtpA蛋白免疫日本的长耳大白兔制备多克隆抗体,ELISA法测定其血清抗体的效价高达1:100000。该结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。